水溶性富勒烯C60的制備及其血液 相容性研究

劉巖+孫嵐+姚紅娟+張英鴿

（中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京100850）

[摘要]目的：制備γ環(huán)糊精-C60超分子化合物，改善C60的水溶性和血液相容性。方法：采用研磨法制備γ環(huán)糊精-C60超分子化合物，利用紅外光譜對其結構進行表征，通過溶血實驗及血漿復鈣實驗對C60、γ環(huán)糊精-C60的血液相容性進行評價。結果：紅外光譜結果表明γ環(huán)糊精與C60發(fā)生包埋，γ環(huán)糊精-C60在雙蒸水中放置24h無聚沉，樣品濃度為512μg/mL 、102.4μg/mL 、25.6μg/mL時，C60的溶血率分別為13.75%±0.26%、6.02±0.12%、3.21±0.19%，γ環(huán)糊精-C60的溶血率分別為3.74%±0.39%、1.13%±0.12%、0.55%±0.19%；陽性對照、C60、γ環(huán)糊精-C60的復鈣時間分別為10min 、15min、20min，對應吸光度值分別為1.09、0.68、0.51 。結論：經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后C60的水溶性和血液相容性得到改善。

[關鍵詞]C60；γ環(huán)糊精；水溶性；血液相容性

中圖分類號：O657文獻標識碼：A文章編號：2095-5200（2014）04-001-03

DOI：10.11876/mimt201404001

Preparation of water-soluble fullerene C60 and its hemocompatibility studyLIU Yan，SUN lan，YAO Hong-juan，ZHANG Ying-ge.（Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850）

[Abstract]Objective：To improve the water-solubility of C60, γ cyclodextrin-C60 supramolecular compounds were prepared. Methods：γ cyclodextrin-C60 supramolecular compounds were prepared by grinding way. The structure of γ cyclodextrin-C60 was characterized by infrared spectroscopy. Then, through the hemolysis experiment and plasma recalcification experiment, the hemocompatibility of C60 and γ cyclodextrin-C60 have been evaluated. Results：FTIR results showed that the γ cyclodextrin embedded with C60. γ cyclodextrin-C60 placed 24h without coagulation in double distilled water. In the concentration of 512μg/mL, 102.4μg/mL, 25.6μg/mL the hemolysis rate of C60 were 13.75% ± 0.26%, 6.02 ± 0.12%, 3.21 ± 0.19% respectively, while γ cyclodextrin-C60 were 3.74% ± 0.39%, 1.13% ± 0.12%, 0.55% ± 0.19% respectively. Recalcification time of positive control, C60 and γ cyclodextrin-C60 was 10min, 15min, 20min and the corresponding absorbance values were 1.09,0.68,0.51. Conclusion：γ cyclodextrin modification can improve water-solubility and hemocompatibility of C60.

[Key words]C60；γ cyclodextrin；water-solubility；hemocompatibility1985年Kroto等首次發(fā)現(xiàn)了碳的第三種同素異形體富勒烯C60 [1]，1990年Kr?tschmer采用石墨電弧放電的方法分離出了克量級C60，使得C60的研究迅速發(fā)展起來[2]。近年來相關研究發(fā)現(xiàn)C60具有良好的醫(yī)學應用前景，如可以作為藥物載體[3]、抗艾滋病藥物[4]、光動力學殺傷腫瘤藥物[5]、X射線對照劑[6]等。但C60的理化性質(zhì)表現(xiàn)出高度疏水性和不良的血液相容性，使其發(fā)展受到限制。為改善C60的水溶性和血液相容性，可以對C60進行功能化修飾，通過引入羥基、羧基等極性官能團來提高C60的親水性和減少血漿蛋白的黏附。本研究采用研磨法制備γ環(huán)糊精- C60超分子化合物，并對其水溶性和血液相容性進行了評價。

1儀器與試劑

C-120S精密電子分析天平（Sartorius，德國），行星式高能球磨機（P7型，德國），離心機（TGL-16G，上海安亭科學儀器廠），旋轉式恒溫振蕩器（DSHZ-300A，太倉市實驗設備廠），紅外光譜儀（Bruker Vertex 70，德國）C60（濮陽市永新富勒烯科技有限公司，純度99.9%），γ環(huán)糊精（damas-beta，瑞士），0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥集團），氯化鈣（北京化學試劑公司，純度≥95%），成人全血（中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所提供）。

2實驗方法與結果

2.1C60的修飾改性

2.1.1γ環(huán)糊精- C60超分子化合物制備稱取54mgγ環(huán)糊精與25mg C60以800 r/mim研磨4h，收集研磨產(chǎn)物于錐形瓶中，加入20mL雙蒸水，置于恒溫振蕩器搖振30min（溫度：37℃、轉速：100 r/min），將混懸液以16000 r/min離心5min，棄下層沉淀，上清液在-20℃冷凍8h后，放入凍干機中干燥。

2.1.2C60與γ環(huán)糊精- C60的水溶性C60/雙蒸水、γ環(huán)糊精- C60/雙蒸水樣品放置24h后，C60產(chǎn)生聚沉，微溶于水，γ環(huán)糊精- C60仍能保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)，無沉淀析出，如圖1所示。

圖1C60（左）與γ環(huán)糊精-C60（右）在水中的溶解性

2.2結構表征

采用溴化鉀壓片法測定C60、γ環(huán)糊精、γ環(huán)糊精- C60的紅外光譜，譜圖結果如圖2所示。

γ環(huán)糊精和C60的紅外測定結果與文獻報道相一致[7-8]。在γ環(huán)糊精-C60的紅外光譜中：1427.6、575.8、526.3cm-1處為C60的特征吸收峰，3401.7、2925.3、1155.4、756.1、704.6 cm-1處為γ環(huán)糊精的特征吸收峰，說明γ環(huán)糊精與C60發(fā)生了包埋。

2.3溶血率測定

（1）將8 mL成人全血用10 mL 生理鹽水稀釋。（2）分別稱取6.4 mg C60和γ環(huán)糊精- C60，用生理鹽水配制成濃度為512μg/mL、102.4μg/mL、25.6μg/mL的樣品，于37℃恒溫放置30 min，向各樣品中加入0.2 mL（1）中所配稀釋血液，輕輕搖勻后于37℃放置60 min，以1500 r/min離心10 min，吸取上清液0.1 mL加入到96孔板中。（3）配制陽性對照樣品：0.2 mL稀釋血液與10 mL超純水混勻；配制陰性對照樣品：0.2 mL稀釋血液與10 mL 生理鹽水混勻；將陽性對照和陰性對照樣品以0.1 mL/孔加入到96孔板中。（4）在545nm處測定吸光度值。溶血率測定結果如圖3所示。

溶血率（%）=（測試樣吸光度值-陰性對照吸光度值）/（陽性對照吸光度值-測試樣吸光度值）

由圖3可知，樣品濃度為512μg/mL 、102.4μg/mL 、25.6μg/mL時，C60的溶血率分別為13.75%±0.26%、6.02%±0.12%、3.21%±0.19%，γ環(huán)糊精- C60的溶血率分別為3.74%±0.39%、1.13%±0.12%、0.55%±0.19%。結果表明C60經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后溶血率降低。

2.4血漿復鈣時間測定

（1）以1000 r/min將成人全血離心10 min，棄下層血小板，得到去血小板血漿；（2）稱取30 mg氯化鈣，用雙蒸水溶解，配制濃度為0.025mol/L的氯化鈣水溶液；（3）稱取C60和γ環(huán)糊精- C60各6.4 mg，用生理鹽水配制成濃度為512μg/mL的樣品，于37℃恒溫放置30 min；（4）向96孔板各孔中加入去血小板血漿、0.025 mol/L的氯化鈣水溶液和待測樣品各100μL，在405nm處測定復鈣時間動力學曲線，間隔5 min采樣一次；（5）陽性對照組采用100μL去血小板血漿加100μL 0.025 mol/L的氯化鈣水溶液，陰性對照組采用100μL去血小板血漿。

圖4血漿復鈣動力學曲線的測定結果顯示：陽性對照組、C60、γ環(huán)糊精- C60復鈣時間分別為10min、15min、20min，對應的吸光度值分別為1.09、0.68、0.51，說明C60經(jīng)環(huán)糊精修飾后復鈣時間延長，生成沉淀減少。

圖 4血漿復鈣時間動力學曲線

3討論

γ環(huán)糊精是一種內(nèi)腔疏水外緣親水的兩親型化合物，其分子內(nèi)空腔表面僅存在糖苷氧原子及覆蓋糖苷氧原子的氫原子而表現(xiàn)出疏水性，空腔尺寸為0.9-1nm大于C60的結構尺寸，可以通過疏水作用對C60進行包埋形成超分子化合物，這種超分子化合物因γ環(huán)糊精外緣含有豐富的羥基而具有良好的水溶性，是一種提高C60水溶性的有效途徑。

溶血實驗是考察受試材料的血液相容性，評價其對紅細胞損害程度的一種方法。當材料與血液接觸后可引起血紅蛋白變性從而導致血液凝固和血栓的形成，溶血率越低表明材料的血液相容性越好。采用γ環(huán)糊精對C60修飾后，各劑量組的溶血率均下降，達到了美國材料試驗協(xié)會（ASTM）認可的溶血率低于5%的良好血液相容性標準。血漿復鈣實驗結果顯示經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后C60的復鈣時間延長，生成沉淀減少，說明抗凝血性得到了提高。這主要是因為γ環(huán)糊精外緣含有大量羥基而帶有負電，可以與同樣帶有負電荷的血漿蛋白產(chǎn)生排斥從而減少血漿蛋白的粘附。綜上所述，采用γ環(huán)糊精對C60進行修飾可以增強其水溶性，改善其血液相容性，為C60在生物醫(yī)藥領域的進一步應用奠定基礎。

參考文獻

[1]Kroto H W, Heath J R, óBrien S C, et al. C60 : Buckminsterfullerene[J]. Nature, 1985, 318: 162-172.

[2]Kr?tschmer W, Lamb L D, Fostiro poulos K, et al. Solid C60: A new form of carbon[J]. Nature, 1990, 347( 27) : 354.

[3]Jinjin Shi, Yan Liu, Lei Wang, et al. A tumoral acidic pH-responsive drug delivery system based on a novel photosensitizer (fullerene) for in vitro and in vivo chemo-photodynamic therapy[J]. Acta Biomaterialia, 2014, 10(3):1280-1291.

[4]Friedman S H, De Camp D L, sijbesma R P, et al. Inhibition of the HIV-1protease by : fullerene derivatives: model building studies and experimental verification[J]. Am. Chem. Soc., 1993, 115: 6506-6509.

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[6]Wharton T, Wilson L J. Toward fullerene-based x-ray contrast agents: design and synthesis of non-ionic,highly-iodinated derivatives[J]. Tetrahedron Lett. 2002,43(4):561-564.

[7]胡全利，禹金強，李村娟，等. C60材料紅外和拉曼特性[J]. 東北大學學報，1996,17(5): 541-543.

[8]劉鳳萍. β-環(huán)糊精交聯(lián)聚合物的合成及紅外光譜研究[J]. 光譜實驗室，2002,19(4): 505-507.

溶血率（%）=（測試樣吸光度值-陰性對照吸光度值）/（陽性對照吸光度值-測試樣吸光度值）

由圖3可知，樣品濃度為512μg/mL 、102.4μg/mL 、25.6μg/mL時，C60的溶血率分別為13.75%±0.26%、6.02%±0.12%、3.21%±0.19%，γ環(huán)糊精- C60的溶血率分別為3.74%±0.39%、1.13%±0.12%、0.55%±0.19%。結果表明C60經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后溶血率降低。

2.4血漿復鈣時間測定

（1）以1000 r/min將成人全血離心10 min，棄下層血小板，得到去血小板血漿；（2）稱取30 mg氯化鈣，用雙蒸水溶解，配制濃度為0.025mol/L的氯化鈣水溶液；（3）稱取C60和γ環(huán)糊精- C60各6.4 mg，用生理鹽水配制成濃度為512μg/mL的樣品，于37℃恒溫放置30 min；（4）向96孔板各孔中加入去血小板血漿、0.025 mol/L的氯化鈣水溶液和待測樣品各100μL，在405nm處測定復鈣時間動力學曲線，間隔5 min采樣一次；（5）陽性對照組采用100μL去血小板血漿加100μL 0.025 mol/L的氯化鈣水溶液，陰性對照組采用100μL去血小板血漿。

圖4血漿復鈣動力學曲線的測定結果顯示：陽性對照組、C60、γ環(huán)糊精- C60復鈣時間分別為10min、15min、20min，對應的吸光度值分別為1.09、0.68、0.51，說明C60經(jīng)環(huán)糊精修飾后復鈣時間延長，生成沉淀減少。

圖 4血漿復鈣時間動力學曲線

3討論

γ環(huán)糊精是一種內(nèi)腔疏水外緣親水的兩親型化合物，其分子內(nèi)空腔表面僅存在糖苷氧原子及覆蓋糖苷氧原子的氫原子而表現(xiàn)出疏水性，空腔尺寸為0.9-1nm大于C60的結構尺寸，可以通過疏水作用對C60進行包埋形成超分子化合物，這種超分子化合物因γ環(huán)糊精外緣含有豐富的羥基而具有良好的水溶性，是一種提高C60水溶性的有效途徑。

溶血實驗是考察受試材料的血液相容性，評價其對紅細胞損害程度的一種方法。當材料與血液接觸后可引起血紅蛋白變性從而導致血液凝固和血栓的形成，溶血率越低表明材料的血液相容性越好。采用γ環(huán)糊精對C60修飾后，各劑量組的溶血率均下降，達到了美國材料試驗協(xié)會（ASTM）認可的溶血率低于5%的良好血液相容性標準。血漿復鈣實驗結果顯示經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后C60的復鈣時間延長，生成沉淀減少，說明抗凝血性得到了提高。這主要是因為γ環(huán)糊精外緣含有大量羥基而帶有負電，可以與同樣帶有負電荷的血漿蛋白產(chǎn)生排斥從而減少血漿蛋白的粘附。綜上所述，采用γ環(huán)糊精對C60進行修飾可以增強其水溶性，改善其血液相容性，為C60在生物醫(yī)藥領域的進一步應用奠定基礎。

參考文獻

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[8]劉鳳萍. β-環(huán)糊精交聯(lián)聚合物的合成及紅外光譜研究[J]. 光譜實驗室，2002,19(4): 505-507.

溶血率（%）=（測試樣吸光度值-陰性對照吸光度值）/（陽性對照吸光度值-測試樣吸光度值）

由圖3可知，樣品濃度為512μg/mL 、102.4μg/mL 、25.6μg/mL時，C60的溶血率分別為13.75%±0.26%、6.02%±0.12%、3.21%±0.19%，γ環(huán)糊精- C60的溶血率分別為3.74%±0.39%、1.13%±0.12%、0.55%±0.19%。結果表明C60經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后溶血率降低。

2.4血漿復鈣時間測定

（1）以1000 r/min將成人全血離心10 min，棄下層血小板，得到去血小板血漿；（2）稱取30 mg氯化鈣，用雙蒸水溶解，配制濃度為0.025mol/L的氯化鈣水溶液；（3）稱取C60和γ環(huán)糊精- C60各6.4 mg，用生理鹽水配制成濃度為512μg/mL的樣品，于37℃恒溫放置30 min；（4）向96孔板各孔中加入去血小板血漿、0.025 mol/L的氯化鈣水溶液和待測樣品各100μL，在405nm處測定復鈣時間動力學曲線，間隔5 min采樣一次；（5）陽性對照組采用100μL去血小板血漿加100μL 0.025 mol/L的氯化鈣水溶液，陰性對照組采用100μL去血小板血漿。

圖4血漿復鈣動力學曲線的測定結果顯示：陽性對照組、C60、γ環(huán)糊精- C60復鈣時間分別為10min、15min、20min，對應的吸光度值分別為1.09、0.68、0.51，說明C60經(jīng)環(huán)糊精修飾后復鈣時間延長，生成沉淀減少。

圖 4血漿復鈣時間動力學曲線

3討論

γ環(huán)糊精是一種內(nèi)腔疏水外緣親水的兩親型化合物，其分子內(nèi)空腔表面僅存在糖苷氧原子及覆蓋糖苷氧原子的氫原子而表現(xiàn)出疏水性，空腔尺寸為0.9-1nm大于C60的結構尺寸，可以通過疏水作用對C60進行包埋形成超分子化合物，這種超分子化合物因γ環(huán)糊精外緣含有豐富的羥基而具有良好的水溶性，是一種提高C60水溶性的有效途徑。

溶血實驗是考察受試材料的血液相容性，評價其對紅細胞損害程度的一種方法。當材料與血液接觸后可引起血紅蛋白變性從而導致血液凝固和血栓的形成，溶血率越低表明材料的血液相容性越好。采用γ環(huán)糊精對C60修飾后，各劑量組的溶血率均下降，達到了美國材料試驗協(xié)會（ASTM）認可的溶血率低于5%的良好血液相容性標準。血漿復鈣實驗結果顯示經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后C60的復鈣時間延長，生成沉淀減少，說明抗凝血性得到了提高。這主要是因為γ環(huán)糊精外緣含有大量羥基而帶有負電，可以與同樣帶有負電荷的血漿蛋白產(chǎn)生排斥從而減少血漿蛋白的粘附。綜上所述，采用γ環(huán)糊精對C60進行修飾可以增強其水溶性，改善其血液相容性，為C60在生物醫(yī)藥領域的進一步應用奠定基礎。

參考文獻

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[3]Jinjin Shi, Yan Liu, Lei Wang, et al. A tumoral acidic pH-responsive drug delivery system based on a novel photosensitizer (fullerene) for in vitro and in vivo chemo-photodynamic therapy[J]. Acta Biomaterialia, 2014, 10(3):1280-1291.

[4]Friedman S H, De Camp D L, sijbesma R P, et al. Inhibition of the HIV-1protease by : fullerene derivatives: model building studies and experimental verification[J]. Am. Chem. Soc., 1993, 115: 6506-6509.

[5]Hidetoshi, Tikuyama, Shigeru, et al. Photoinduced biochemical activity of fullerene carboxylic acid[J]. Am. Chem. Soc.,1993, 115(17): 7918-7919.

[6]Wharton T, Wilson L J. Toward fullerene-based x-ray contrast agents: design and synthesis of non-ionic,highly-iodinated derivatives[J]. Tetrahedron Lett. 2002,43(4):561-564.

[7]胡全利，禹金強，李村娟，等. C60材料紅外和拉曼特性[J]. 東北大學學報，1996,17(5): 541-543.

[8]劉鳳萍. β-環(huán)糊精交聯(lián)聚合物的合成及紅外光譜研究[J]. 光譜實驗室，2002,19(4): 505-507.