pEGFP-HSP70重組質粒的構建及其在大鼠神經干細胞中的表達*

舒曉明, 逯 丹, 王 珍, 張嬋娟, 趙佳儀, 朱麗紅, 戚仁斌, 陸大祥

(暨南大學醫學院病理生理學系，國家中醫藥管理局重點實驗室，廣東 廣州 510632)

隨著蛋白質研究的深入，人們發現更多疾病的真正原因與蛋白質異常折疊有關，如阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)、帕金森病(Parkinson disease, PD)、亨廷頓舞蹈癥(Huntington disease, HD)、牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy，BSE)、家族性高膽固醇血癥、某些腫瘤等稱之為“蛋白折疊病”[1]。而分子伴侶在蛋白質的折疊中起至關重要的作用，熱休克蛋白70(heat-shock protein 70, HSP70)與多肽之間的可逆作用在蛋白質的折疊、轉運、錯誤折疊多肽的降解及其調控過程中有著重要的作用[2-3]。

現今對神經退行性疾病的治療還停留在對癥治療階段，仍不能對該類疾病進行根本性的治療。而基因治療極有可能為該類疾病的治療帶來根本性的突破，在其治療中合理選擇基因靶細胞又是基因治療成敗的關鍵因素。由于神經干細胞(neural stem cells, NSCs)具備以下特點：能自我維持更新的能力，足以提供大量細胞；具有多向分化潛能，可分化為神經元、星形膠質細胞或少突膠質細胞；有一定遷移能力，能到達損傷或疾病部位并產生新的細胞。因其來源于胎腦神經組織,與宿主腦組織能很好整合,能在腦內增殖和分化[4-5]且有較低的免疫源性而被廣泛地作為神經系統基因治療的理想載體，這樣能從根本上解決退行性疾病的功能神經元變性和數量的減少。攜帶了HSP70基因的神經干細胞能夠從多靶點、多途徑上有效地干預神經退行性疾病，是較為理想的治療方法。

材 料 和 方 法

1 材料

大腸桿菌JM109、pMD19-T Simple平滑載體及質粒pEGFP-C2為TaKaRa產品。TRIzol試劑、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、cDNA合成試劑盒、TaqDNA聚合酶、X-Gal和IPTG為TaKaRa產品。表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)購自PeproTech。胎鼠神經干細胞傳至第4代。Nucleofector device 及轉染試劑(Lonza)。 DMEM/F12細胞培養基和單克隆鼠抗nestin (Millipore)。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的山羊抗小鼠Ⅱ抗和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)購自上海生物工程公司。Olympus IX51型熒光倒置相差顯微鏡。

2 方法

2.1質粒pEGFP-HSP70的構建

2.1.1引物設計 根據GenBank報道的大鼠HSP70的全長cDNA序列(L16764.1),經Primer Premier 5.0分析,設計2個引物: 正義引物5’-CGGAATTCGATGGCCAAGAAAACAGCGATCG-3’，反義引物5’-CGCGGATCCGCGTAATCCACCTCCTCGATGG-3’。正義引物為HSP70全長cDNA 5’端的序列,引入EcoRⅠ酶切位點,含啟始密碼子ATG。反義引物為HSP70全長cDNA 3’端序列的互補序列,引入BamHⅠ酶切位點。

2.1.2總RNA的提取 取約100 mg新鮮SD大鼠胎肝組織,按步驟提取總RNA。凝膠電泳及A260/A280值明顯提示所抽提的RNA是符合實驗要求的。

2.1.3HSP70 cDNA的合成與PCR擴增測序 以Total RNA為模板,使用TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV) Ver.1.1進行RT反應,合成cDNA。再以合成的cDNA為模板,進行PCR擴增目的片段。按常規的PCR反應條件,取2 μL反轉錄產物為模板,先將樣品于95 ℃變性5 min,加入2 UTaqDNA聚合酶,按下列參數循環30次:95 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,最后一個循環72 ℃ 10 min。若擴增片段量少,可進行2次PCR擴增反應。并切膠回收目的片段,溶于15 μL ddH2O。使用DNA連接試劑將Insert DNA與pMD19-T Simple平滑載體連接后,熱轉化至E.coliCompetent JM109 細胞中,涂布平板后,37 ℃過夜培養。挑選陽性菌落，提取陽性克隆并命名后進行測序。測序后編號為ZL-8標本符合要求。

2.2HSP70 cDNA真核表達載體的構建 質粒pEGFP-C2及ZL-8用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切,切膠回收DNA片段。將載體和Insert片段連接,構建在體轉基因重組質粒pEGFP-HSP70, 熱轉化至E.coliCompetent DH5α中,涂布平板過夜培養。挑選菌落,提取質粒后,再行雙酶切檢測,確認目的片段是否插入，酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2.3神經干細胞轉染 取孕15 d的SD胎鼠，分離腦海馬組織，進行神經干細胞培養[6]。培養基采用DMEM/F12、EGF 20 μg/L、bFGF 20 μg/L和2%B27，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養,第1次換液在4～5 d后，以后按2 d換液1次。選取傳代4次的NSCs進行實驗[7]。轉染采用Nucleofector device 及轉染試劑，程序采用A-33。轉染后24 h開始進行熒光顯微鏡觀察, 培養克隆擴增陽性的熒光細胞, 采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對陽性的神經干細胞進行計數分析。

2.4神經干細胞鑒定 采用免疫組化方法：培養在載玻片上的細胞用4%多聚甲醛固定 30 min，在通風柜里晾干，0.01 mol/L PBS 漂洗 5 min×3 次，0.5% Triton X-100+10%山羊血清封閉30 min；加入Ⅰ抗小鼠抗大鼠nestin(1∶100)，轉入 4 ℃過夜；0.01 mol/L PBS 漂洗 5 min×3 次；加入 FITC 標記的山羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶100)，37 ℃、2 h避光；0.01 mol/L PBS 漂洗 5min×3 次；0.5% DAPI染色避光，1 h、0.01 mol/L PBS 漂洗 5 min×3 次，晾干，中性樹脂封片。

2.5Western blotting檢測及熒光觀察 收集神經干細胞，抽提蛋白并測定蛋白濃度，加入等體積的上樣緩沖液煮沸5 min待用。配制5%濃縮膠和10%分離膠，上樣后電泳，用 60 mV電壓使樣品跑至分離膠后，用90 mV電壓電泳至溴酚藍距離底線0.5 cm左右。 電泳后取出硝酸纖維素膜及濾紙，按次序疊放在電轉槽中，根據目的蛋白的分子量決定電轉時間。牛奶封閉后加Ⅰ抗、Ⅱ抗稀釋液，振搖孵育，用現配制的顯色液避光顯色。圖像處理軟件進行蛋白灰度分析。

使用Olympus IX51型熒光倒置相差顯微鏡進行熒光觀察,觀察轉染后的神經干細胞中綠色熒光的表達,用488 nm波長紫外光激發,發射光波長為507 nm,選取 24 h、7 d、14 d及21 d熒光強度并使用 Image-Pro Plus 6.0軟件分析。

3 統計學處理

數據用均數±標準誤(mean±SEM)表示。采用 SPSS 15.0 統計軟件進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠HSP70 cDNA的克隆

我們以TRIzol試劑來提取大鼠胎肝組織的總RNA,A260/A280為2.0, 凝膠電泳分析可見28S及18S兩條RNA條帶，說明抽提的總RNA符合實驗要求。以上述合成的cDNA為模板進行PCR擴增后得到1條約1 926 bp的清晰條帶;使用DNA連接試劑將Insert DNA與pMD19-T Simple平滑載體連接后,熱轉化至E.coliCompetent JM109 細胞中,涂布平板后,37 ℃過夜培養。挑取陽性克隆質粒進行測序，結果提示質粒ZL-8的序列與文獻報道的序列一致。

2 重組質粒的構建

真核表達載體pEGFP-C2是一個帶有突變綠色熒光蛋白的cDNA報告基因 ,在熒光顯微鏡下能夠檢測到該載體的表達。將克隆在pMD19-T Simple平滑載體中的大鼠HSP70基因片段以EcoRⅠ及BamHⅠ雙酶切,經凝膠電泳分離；再與真核表達載體pEGFP-C2經雙酶切及連接酶作用后構建成重組pEGFP-HSP70，見圖1、2。

Figure 1. Construction of recombinant plasmid pEGFP-C2/HSP70.

3 神經干細胞提取及鑒定

從SD大鼠的胎鼠海馬組織提取原代神經細胞干細胞。加入無血清的干細胞培養液，傳至第4代用nestin抗體進行鑒定分析，鑒定后確認為神經干細胞，見圖3。

4 神經干細胞的轉染及表達

構建好的pEGFP-HSP70轉染細胞后12 h就有熒光表達, 24 h熒光進一步增強 ,且一定時間內綠色熒光蛋白表達增多、亮度增強，2周之后熒光強度明顯降低；HSP70的表達在14 d升高到最高后也逐漸降低，見圖4～6。

Figure 2. Identification of PCR product (A) and recombinant pEGFP-C2/HSP70 plasmid (B) by enzyme digestion.M1: DL2000 DNA marker: M2:λ-Hind Ⅲ digest; 1: PCR product; 2: positive control; 3: negative control; 4: pEGFP-C2 digested by EcoR I and BamH I; 5: pEGFP-C2/HSP70 digested by EcoR I and BamH I; 6: pMD19-T/HSP70 digested by EcoR I and BamH I.

Figure 3. Identification of neural stem cells. Neurospheres were stained with nestin.Abundant fluorescent neurospheres were present. Scale bars: 20 μm.

Figure 4. Comparison of fluorescence intensity of each group 24 h after transfection (×100).Mean±SEM．n=6.**P<0.01 vs control.

討 論

當前隨著世界人口的老齡化，神經退行性疾病人數急劇上升。據統計2013年美國有520萬人患有AD，100萬人患有PD[8]。今年估計45萬美國人會死于AD。AD已成為心腦血管疾病及腫瘤之后又一大致死病因。這給家庭和社會造成了巨大的精神和經濟負擔[9-10]，引起了全社會的高度關注。神經干細胞具有自我復制、增殖的能力，定向分化的特征，被醫學界廣泛認為在神經退行性疾病的治療中干細胞治療占有十分重要的地位，已成為醫學研究的熱點。大量的研究表明：使用細胞因子或細胞因子誘導劑可以誘導神經干細胞分化成特定的功能性神經細胞，直接修復和替代受損神經細胞；另一方面移植的干細胞自身也能產生大量細胞因子參與修復損傷過程。神經干細胞及轉基因神經干細胞的治療最有可能成為該類疾病根治的希望。當神經干細胞以及攜帶目的基因或細胞因子的基因植入體內，既可表達外源性基因，產生相應的生長因子或細胞因子，誘導自身干細胞定向分化；又可補充神經細胞的不足，達到基因治療和細胞替代的雙重作用[11]。

Figure 5. Structural gene containing neural stem cells in fluorescence intensity at each time point(×100). Mean±SEM．n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs 1 d.

Figure 6. HSP70 of expression in neural stem cells. Mean±SEM．n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs control.

“分子伴侶”在生物生命活動占有極其重要的地位，HSP70是最主要的成分和最重要的功能單位，它輔助形成特定的蛋白質構象并維持蛋白質正常的構象，既可幫助新合成多肽鍵的生理折疊與伸展，也可使未折疊的多肽鏈更加穩定。當機體發生異常時，蛋白質構象發生異常變化導致蛋白質錯誤折疊并聚集; 可反應性引起HSP70表達的上調，識別和結合異常蛋白質，并通過ATP酶作用產生能量，改變蛋白的異常折疊，并輔助其重新折疊;保護正常蛋白質不與變性蛋白質相互結合，從而阻止蛋白質的異常聚積。而許多神經退行性疾病其發病的機制就是由于蛋白的異常折疊并聚合形成了毒性病理產物，引起了疾病的發生發展。其外，HSP70在機體應激時加快正常蛋白質合成，使應激時造成的蛋白質數量的減少得到補充，并可幫助維持蛋白的跨膜轉運，保證線粒體、內質網等正常功能的發揮。

在我們選取HSP70作為目的基因，神經干細胞作為靶細胞，pEGFP-C2作為表達載體，構建重組質粒pEGFP-C2/HSP70。而pEGFP-C2為一種帶增強型綠色熒光蛋白報告基因的真核表達載體,能將克隆至其中的目的片段高效表達并利于觀察。轉染采用Lonza公司發明的Nucleofector 轉染技術，該技術是將電穿孔技術和專用的優化轉染試劑結合起來，對不同的細胞類型，采用最優化的轉染程序。我們觀察到pEGFP-HSP70轉染神經干細胞效率達 50%左右，細胞的存活率近 85%。Nucleofector 技術與脂質體及病毒轉染載體相比優點明顯，可以更貼近臨床應用，其外，操作較為簡單，轉染效率較高，尤其對懸浮的、難轉細胞優勢明顯。我們的實驗發現重組質粒pEGFP-HSP70轉染干細胞后，其熒光強度及HSP70的表達與時間密切相關，轉染24 h至2周有較高的熒光強度及HSP70的表達，2周后衰減明顯，這為轉基因干細胞選擇最佳移植治療時期提供了有價值的依據。神經干細胞移植治療因蛋白折疊所致的退行性疾病是一種較有效的方法, 特別是當神經干細胞攜帶有靶向治療基因HSP70基因后,我們前期的實驗已證明能明顯改善了AD模型鼠的行為學指標，達到治療目的。

[參 考 文 獻]

[1] Findeis MA. The role of amyloid beta peptide 42 in Alzheimer’s disease [J]. Pharmacol Ther，2007，116(2):266-286.

[2] Sarkar M, Kuret J, Lee G. Two motifs within the tau microtubule-binding domain mediate its association with the hsc70 molecular chaperone [J]. J Neurosci Res，2008，86(12):2763-2773.

[3] Rujano MA, Kampinga HH, Salomons FA. Modulation of polyglutamine inclusion formation by the Hsp70 chaperone machine [J]. Exp Cell Res， 2007，313(16):3568-3578.

[4] Liu WG, Wang XJ, Lu GQ, et al. Retraction: Dopaminergic regeneration by neurturin overexpressing c17.2 neural stem cells in a rat model of Parkinson’s disease [J]. Mol Neurodegeneration，2009, 4:45.

[5] Wong AM, Hodges H, Horsburgh K. Neural stem cell grafts reduce the extent of neuronal damage in a mouse model of global ischaemia [J]. Brain Res, 2005, 1063 (2): 140-150.

[6] Blurton-Jones M, Kitazawa M, Martinez-Coria H, et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(32):13594-13599.

[7] Deng X, Liu R, Feng Z, et al.Invitroculture and differentiation of rat embryonic midbrain-derived neural stem cells [J]. Neural Regen Res,2008, 3(11):1241-1244.

[8] Ferri CP, Prince M, Brayne C, et al. Global prevalence of dementia: a Delphi consensus study [J]. Lancet, 2005, 366(9503): 2112-2117.

[9] Alzheimer’s Association.2013 Alzheimer’s disease facts and figures [J]. Alzheimers Dement, 2013, 9(2):208-245.

[10] Zhao R, Xuan Y, Li X, et al. Age-related changes of germline stem cell activity, niche signaling activity and egg production in Drosophila [J]. Aging Cell, 2008, 7(3): 344-354.

[11] 王 瑒，李 正，王小娜，等.雷奈酸鍶通過上調骨形態發生蛋白2的表達促進骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞[J]. 中國病理生理雜志，2012, 28(3): 404-408.