離子對液相色譜法測定柴枳四逆散中 辛弗林的含量

邱紅+胡筱梅

（湖北醫藥學院附屬東風醫院檢驗科，湖北十堰442008）

[摘要]目的：建立測定柴枳四逆散中辛弗林含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜條件為Fortis C18色譜柱（4.6×250mm，5μm），流動相為甲醇-磷酸二氫鉀溶液（43：57），流速為1.0ml·min-1，柱溫：30℃，檢測波長為275nm。結果：辛弗林在1.82～36.40μg·ml-1（r=0.9999）濃度范圍內有良好的線性關系，平均加樣回收率為98.0%，RSD 為1.50%。結論：本方法準確，重復性好，可用于柴枳四逆散中辛弗林的測定。

[關鍵詞]辛弗林；柴枳四逆散；離子對高效液相色譜法

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：B文章編號：2095-5200（2014）04-069-03

DOI：10.11876/mimt201404022

Determination of synephrine in Caizhi Sini Powder by Ion-Pair HPLCQIU Hong，HU Xiao-mei.（Department of clinical laboratory, Affiliated Dongfeng Hospital, Hubei Medical University, Hubei Shiyan 442008, China）

[Abstract]Objective：To establish a method for the determination of synephrine in Caizhi Sini Powder. Method：The RP-HPLC system consisting the Fortis C18（4.6×250mm, 5μm）column, the mobile phase consisted of MeOH –KH2PO4 (43: 57), the flow rate was 1.0ml·min-1, the column temperature was 30℃,The UV detector was set at 275nm. Results：The linear response range was 1.82～36.40μg·ml-1（r=0.9999）.The average recovery of schisandrin was 98.0%, RSD was 1.50%. Conclusions：The assay demonstrated that the method was simple and accurate, repeatable, it can be applied in determination of schisandrin in synephrine in Caizhi Sini Powder.

[Key words]synephrine；Caizhi Sini Powder；Ion-Pair-HPLC柴枳四逆散為原國家衛生部部頒藥品標準收載中藥成方制劑[1]，以柴胡、枳實、白芍、甘草4味中藥所組成。具有疏肝理脾之功效。主要用于熱厥手足不溫，胸脅痞滿，下痢腰痛等癥候。枳實為方中君藥性苦；辛；寒。歸脾；胃；肝；心經。具有，消痰癖，祛停水，逐宿食，破結胸，通便閉之功效。主要用于積滯內停；痞滿脹痛；大便秘結；瀉痢后重；結胸等病癥。現代藥理研究表明，枳實含有豐富的黃酮類、維生素、有機酸、類黃酮等成分[2]。枳實提取物、枳實注射液及其有效成分對羥福林（辛弗林）有強心、增加心輸出量、收縮血管、提高總外周阻力，而使左室壓力和動脈血壓上升的作用[3]。辛弗林除具有升壓、抗休克作用外，還具有提高新陳代謝、增加熱量消耗、提高能量水平、氧化脂肪、減肥作用[4]。

本方原質量標準中尚無含量測定項，為更確切研究本方劑的藥理作用與枳實用量的關系，本研究建立了高效液相色譜法測定方中主藥枳實的活性成分辛弗林的含量，現將具體方法報道如下。

1儀器與試藥

Dionex-U3000液相色譜儀（德國Dionex公司，U3000 二極管陣列檢測器，Dionex Chemeleon色譜工作站），SK5200H超聲波清洗機（超聲儀器有限公司）；梅特勒MS105DU型電子天平（d=0.01mg）；辛弗林（1110727 - 20 0306，供含量測定用，由中國食品藥品檢定研究院提供，純度≥98.5%），甲醇（色譜純，美國Fisher公司），水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。柴枳四逆散及陰性空白制劑（自制，規格：10g/袋）。

2方法與結果

2.1對照品溶液的制備

使用電子分析天平，精密稱定經真空干燥減壓器中減壓恒重干燥的辛弗林適量，加水制成每1ml含36.4μg的溶液。

2.2供試品溶液及陰性對照溶液的制備

精密稱定本品2.0g，置錐形瓶中，密塞，精密加入50mL甲醇，稱定重量，加熱回流1.5h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續濾液10mL，蒸干，殘渣加水10mL使溶解，通過聚酰胺柱（60～90目，2.5g，內徑為1.5cm，干法裝柱），用水25mL洗脫，收集洗脫液，轉移至25mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.3色譜條件

色譜柱： Fortis C18（4.6×250mm，5μm）；流動相：甲醇-磷酸二氫鉀溶液（取磷酸二氫鉀0.6g，十二烷基磺酸鈉1.0g，冰醋酸1mL，加水溶解并稀釋至1000mL）（43：57）[5-9]；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；檢測波長：275nm；進樣量：10μL。在此色譜條件下，辛弗林理論塔板數不小于3000，色譜圖見圖1。柴枳四逆散中其他成分對辛弗林的含量測定無影響。

2.4標準曲線與線性范圍

吸取辛弗林溶液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0mL置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，混合均勻，辛弗林濃度分別為1.82、3.64、7.28、18.20、29.12、36.40μg·mL-1，分別進樣10μL，按以上色譜條件進行分析，以辛弗林色譜峰面積（Y）對辛弗林對照品濃度（X）進行線性回歸，結果： Y=1.2596X-0.0457，r=0.9999，線性范圍為1.82～36.40μg·mL-1。

2.5精密度試驗

照“2.3”項下條件準備色譜分析，連續測試同一辛弗林對照品溶液6次，記錄辛弗林色譜峰面積，結果顯示辛弗林相對保留時間一致，辛弗林色譜峰面積的RSD為1.16%，說明實驗精密度好。

2.6穩定性試驗

取同一批柴枳四逆散，照“2.2供試品溶液制備”項下操作，制備供穩定性測試的供試品溶液，室溫下取該供試品溶液分別在0，2，4，8，12、24h分析測定，計算辛弗林色譜峰面積RSD為1.48%，結果說明處理后的柴枳四逆散供試品在24h內穩定性好。

2.7重復性試驗

稱取柴枳四逆散（批號20110508）6份，按“2.2供試品溶液制備”項下操作，制備供重復性測試的供試品溶液，每份柴枳四逆散制備2個供試品溶液，每個供試品溶液連續測定兩次，記錄辛弗林色譜峰面積，用外標兩點法計算辛弗林在柴枳四逆散中的含量，并將所得含量結果計算平均含量為1.02mg·g-1，RSD為1.58%。顯示本實驗的重復性好。

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2.8加樣回收率試驗

精密稱取柴枳四逆散（批號：20110508，辛弗林含量：1.02mg·g-1）9份，每份1.0g，每份柴枳四逆散中按高、中、低三種不同濃度精密加入辛弗林對照品（36.4μmg·mL-1）25、28、30mL，照“2.2供試品溶液制備”項下操作，制備供加樣回收率試驗的供試品溶液，按相同色譜條件分析，測定辛弗林色譜峰面積，計算本實驗中辛弗林的加樣回收率，結果見表1。

2.9樣品測定

按上述色譜條件對5批樣品進行測定，外標兩點法計算含量，結果見表2。

表2樣品測定結果（n=3）

批號 辛弗林（mg·g-1）

20110508 1.02

20110514 1.05

20110519 1.03

20110523 1.07

20110530 1.03

3結論

通過對5批柴枳四逆散中辛弗林的含量測定，結果辛弗林的平均含量為1.04mg·g-1。中國藥典2010年版一部規定枳實中辛弗林的含量不低于3.0mg·g-1。由于本方為復方制劑，加上制劑過程中的損耗，因此可制定柴枳四逆散中辛弗林的含量不低于1.0mg·g-1的標準，用于本制劑的質量控制。

4討論

4.1離子對試劑的選擇

使用HPLC法分析電離能力比較強的樣品時，樣品在反相色譜柱上的保留時間很短或者根本不保留，這時要加入相應的離子對試劑，將分析物上的離子進行結合，形成在柱子上有保留的分子。離子對試劑種類和濃度對分離效果都有較大的影響。辛弗林為弱堿性,在普通色譜柱上不易保留，分離效果很差。選用十二烷基磺酸鈉作為離子對試劑并且加入冰醋酸調節流動相使成酸性獲得較為滿意的辛弗林分離效果。

4.2選用聚酰胺柱層析法制備供試品

主要是由于聚酰胺分子中酰胺基與黃酮類化合物分子上的酚羥基形成氫鍵締合而產生吸附作用。辛弗林分子中羥基的數目和位置決定了吸附的強度。實驗過程中曾發現聚酰胺層析流速慢及低分子雜質（聚酰胺）混入的問題。采取預先過篩除去聚酰胺細粉或與硅藻土混合制粒，提高流速；而低分子雜質的干擾，則在裝柱時先用10%鹽酸預洗除去聚酰胺中的小分子雜質。

參考文獻

[1]衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準：中藥成方制劑：第十二冊[S].WS3-B-2404-97，Z12-54.

[2]肖培根. 新編中藥志 (二卷) [M]. 2版.北京：化學工業出版社，2002：459- 460.

[3]Bouchard N, How landM, Greller H, et al Ischemic stroke associated with use of an ephed A-free dietary supplement containing synephrine[C]. Mayo Clinic，2005, 80(4): 541- 545.

[4]官福蘭, 王如俊. 枳殼中辛弗林對小鼠胃排空、小腸推進功能的影響[J]. 現代中西醫結合雜志，2002，11(11): 1001-1003..

[5]國家藥典委員會.《中國藥典》（一部）[S]. 中國醫藥科技出版社，2010，230．

[6]趙宇, 謝培山, 盧平華, 等. 枳實、 枳殼、 青皮和陳皮等藥材中辛弗林含量測定研究[J]. 世界科學技術-中藥現代化，2003，28(5) ：64-67.

[7]康四和.HPLC測定小兒消積止咳口服液中辛弗林、氫溴酸檳榔堿的含量[J].中國中藥雜志，2011，36（10）：1298-1300.

[8]魏清芳，辛愛玲，王嘉林. HPLC法測定木香順氣丸中辛弗林的含量[J]. 安徽醫藥，2010，14（11）：1290-1292.

[9]肖鳴, 吳永宗, 朱良輝, 等. 不同產地枳殼中柚皮苷及辛弗林含量測定[J].中藥材, 2000, 23( 5 ): 267- 268.

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2.8加樣回收率試驗

精密稱取柴枳四逆散（批號：20110508，辛弗林含量：1.02mg·g-1）9份，每份1.0g，每份柴枳四逆散中按高、中、低三種不同濃度精密加入辛弗林對照品（36.4μmg·mL-1）25、28、30mL，照“2.2供試品溶液制備”項下操作，制備供加樣回收率試驗的供試品溶液，按相同色譜條件分析，測定辛弗林色譜峰面積，計算本實驗中辛弗林的加樣回收率，結果見表1。

2.9樣品測定

按上述色譜條件對5批樣品進行測定，外標兩點法計算含量，結果見表2。

表2樣品測定結果（n=3）

批號 辛弗林（mg·g-1）

20110508 1.02

20110514 1.05

20110519 1.03

20110523 1.07

20110530 1.03

3結論

通過對5批柴枳四逆散中辛弗林的含量測定，結果辛弗林的平均含量為1.04mg·g-1。中國藥典2010年版一部規定枳實中辛弗林的含量不低于3.0mg·g-1。由于本方為復方制劑，加上制劑過程中的損耗，因此可制定柴枳四逆散中辛弗林的含量不低于1.0mg·g-1的標準，用于本制劑的質量控制。

4討論

4.1離子對試劑的選擇

使用HPLC法分析電離能力比較強的樣品時，樣品在反相色譜柱上的保留時間很短或者根本不保留，這時要加入相應的離子對試劑，將分析物上的離子進行結合，形成在柱子上有保留的分子。離子對試劑種類和濃度對分離效果都有較大的影響。辛弗林為弱堿性,在普通色譜柱上不易保留，分離效果很差。選用十二烷基磺酸鈉作為離子對試劑并且加入冰醋酸調節流動相使成酸性獲得較為滿意的辛弗林分離效果。

4.2選用聚酰胺柱層析法制備供試品

主要是由于聚酰胺分子中酰胺基與黃酮類化合物分子上的酚羥基形成氫鍵締合而產生吸附作用。辛弗林分子中羥基的數目和位置決定了吸附的強度。實驗過程中曾發現聚酰胺層析流速慢及低分子雜質（聚酰胺）混入的問題。采取預先過篩除去聚酰胺細粉或與硅藻土混合制粒，提高流速；而低分子雜質的干擾，則在裝柱時先用10%鹽酸預洗除去聚酰胺中的小分子雜質。

參考文獻

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[8]魏清芳，辛愛玲，王嘉林. HPLC法測定木香順氣丸中辛弗林的含量[J]. 安徽醫藥，2010，14（11）：1290-1292.

[9]肖鳴, 吳永宗, 朱良輝, 等. 不同產地枳殼中柚皮苷及辛弗林含量測定[J].中藥材, 2000, 23( 5 ): 267- 268.

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2.8加樣回收率試驗

精密稱取柴枳四逆散（批號：20110508，辛弗林含量：1.02mg·g-1）9份，每份1.0g，每份柴枳四逆散中按高、中、低三種不同濃度精密加入辛弗林對照品（36.4μmg·mL-1）25、28、30mL，照“2.2供試品溶液制備”項下操作，制備供加樣回收率試驗的供試品溶液，按相同色譜條件分析，測定辛弗林色譜峰面積，計算本實驗中辛弗林的加樣回收率，結果見表1。

2.9樣品測定

按上述色譜條件對5批樣品進行測定，外標兩點法計算含量，結果見表2。

表2樣品測定結果（n=3）

批號 辛弗林（mg·g-1）

20110508 1.02

20110514 1.05

20110519 1.03

20110523 1.07

20110530 1.03

3結論

通過對5批柴枳四逆散中辛弗林的含量測定，結果辛弗林的平均含量為1.04mg·g-1。中國藥典2010年版一部規定枳實中辛弗林的含量不低于3.0mg·g-1。由于本方為復方制劑，加上制劑過程中的損耗，因此可制定柴枳四逆散中辛弗林的含量不低于1.0mg·g-1的標準，用于本制劑的質量控制。

4討論

4.1離子對試劑的選擇

使用HPLC法分析電離能力比較強的樣品時，樣品在反相色譜柱上的保留時間很短或者根本不保留，這時要加入相應的離子對試劑，將分析物上的離子進行結合，形成在柱子上有保留的分子。離子對試劑種類和濃度對分離效果都有較大的影響。辛弗林為弱堿性,在普通色譜柱上不易保留，分離效果很差。選用十二烷基磺酸鈉作為離子對試劑并且加入冰醋酸調節流動相使成酸性獲得較為滿意的辛弗林分離效果。

4.2選用聚酰胺柱層析法制備供試品

主要是由于聚酰胺分子中酰胺基與黃酮類化合物分子上的酚羥基形成氫鍵締合而產生吸附作用。辛弗林分子中羥基的數目和位置決定了吸附的強度。實驗過程中曾發現聚酰胺層析流速慢及低分子雜質（聚酰胺）混入的問題。采取預先過篩除去聚酰胺細粉或與硅藻土混合制粒，提高流速；而低分子雜質的干擾，則在裝柱時先用10%鹽酸預洗除去聚酰胺中的小分子雜質。

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[4]官福蘭, 王如俊. 枳殼中辛弗林對小鼠胃排空、小腸推進功能的影響[J]. 現代中西醫結合雜志，2002，11(11): 1001-1003..

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[8]魏清芳，辛愛玲，王嘉林. HPLC法測定木香順氣丸中辛弗林的含量[J]. 安徽醫藥，2010，14（11）：1290-1292.

[9]肖鳴, 吳永宗, 朱良輝, 等. 不同產地枳殼中柚皮苷及辛弗林含量測定[J].中藥材, 2000, 23( 5 ): 267- 268.

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