葛根素聯用沙格列汀對2型糖尿病大鼠腎臟纖維化的影響*

金 鑫， 黃 華， 丁伯平， 黃幀檜

(皖南醫學院藥理學教研室及中藥藥理國家三級實驗室，安徽 蕪湖 241002)

腎臟纖維化是在損傷刺激作用下，腎臟固有細胞(包括纖維細胞、系膜細胞和上皮細胞等)被大量細胞外基質取代，分泌細胞因子和炎癥介質等，破壞腎臟正常結構[1]。它是所有腎臟疾病發展到慢性腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎，主要表現為腎小球硬化和腎間質纖維化。研究[2]表明，腎臟中固有細胞的活化和損傷，引起腎間質單核-巨噬細胞浸潤，進而釋放大量生長因子和趨化黏附因子等促纖維化因子，最終導致腎臟纖維化的形成和基質蛋白合成增多、沉積。糖尿病的產生和發展會引起一系列并發癥，腎臟損傷是其中之一，據統計2010年全球糖尿病腎病患者已達到2.8億，而且以每年2.2%的速度增長。而血糖水平的降低對延緩糖尿病并發癥具有重要的作用[3]。

葛根素是從豆科植物野葛根的干燥根中提取的主要有效成分，其化學名稱為4，7-二羥基-8-β-D葡萄糖異黃酮，屬于異黃酮化合物。葛根素具有降低血糖[4]、血壓與血脂[5]，還能抑制炎癥反應，對心肌梗死[6]、糖尿病腎病[7]患者起保護作用。在高血糖治療方面，葛根素是一種胰島素增敏劑[8]。沙格列汀是一種高效二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4, DPP-4)抑制劑，通過選擇性抑制DPP-4來調節血糖[9]，是一類新型降糖藥。研究表明, 沙格列汀可以保護腎臟[10]。二甲雙胍是雙胍類降血糖藥物[11]，其機制是通過提高胰島素敏感性而增加外周對葡萄糖的利用。二甲雙胍聯用沙格列汀治療糖尿病優于各自單藥治療，并且對腎臟具有保護作用[12]。據此，我們推測葛根素聯用沙格列汀對糖尿病腎病大鼠腎臟應具有保護作用，本實驗旨在探討這2種藥物合用對糖尿病大鼠腎臟纖維化的影響及其可能機制。

材 料 和 方 法

1 動物、藥品、試劑和儀器

健康雄性Wistar大鼠(n=50)，體質量150～180 g，由南京青龍山動物實驗中心提供，許可證號為SCXK(蘇)2009-0001。大鼠在22～24 ℃、濕度60%～65%環境下分籠飼養，每籠1只，每日自由進食飲水。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ; Sigma)；葛根素注射液(方明藥業集團有限公司)；沙格列汀片(中美上海施貴寶制藥有限公司)；二甲雙胍(河北山姆士藥業有限公司)。糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin 1c, HbA1c)測定試劑盒、大鼠巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)與TNF-α試劑盒、RT-PCR試劑盒均來自合肥安啟生物科技有限公司。

JA5003N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；22R高速低溫離心機(Beckman Coulter)；ELx800自動酶標儀(Bio-TEK)；電熱干燥箱(上海精密試驗設備有限公司)；-20 ℃低溫冰箱(Beckman Coulter)；凝膠成像分析系統(江蘇捷達科技發展有限責任公司)；血糖測定儀(臺欣)。

2 方法

2.1動物造模及分組 50只雄性Wistar大鼠，給予飼料適應性喂養1周后，隨機抽取8只大鼠作為正常對照組(A組，n=8)，其余大鼠制造2型糖尿病模型[13]，即高糖高脂飼料喂養6周以后，腹腔1次注射STZ(45 mg/kg)，72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L說明造模成功。將造模成功的39只糖尿病大鼠隨機分為糖尿病對照組(B組，n=8)、葛根素治療組(C組，n=7)、沙格列汀治療組(D組，n=8)、葛根素聯用沙格列汀治療組(E組，n=8)和二甲雙胍聯用沙格列汀治療組(F組，n=8)。C組每天給予葛根素注射液80 mg/kg腹腔注射；D組每天給予沙格列汀10 mg/kg灌胃；E組每天給予葛根素注射液40 mg/kg腹腔注射和沙格列汀5 mg/kg灌胃；F組每天給予鹽酸二甲雙胍注射液50 mg/kg和沙格列汀5 mg/kg灌胃。A組和B組每天給予相應量的生理鹽水腹腔注射。連續給藥8周，期間每周測1次體重，根據體重調整給藥劑量，每周使用1次血糖儀測量尾靜脈血糖。

2.2樣品采集 給藥8周后禁食12 h測空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)，將實驗大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，立即抽取腹主動脈血，放置干燥管中，使用22R高速低溫離心機離心，取上清液待測；取雙側腎臟，經生理鹽水反復灌洗，去除包膜后稱重，放置-80 ℃的冰箱中保存備用。

2.3生化指標測定 分離出的血清嚴格按照試劑盒說明操作，測定HbA1c。使用ELISA試劑盒測定TNF-α和MIF。

2.4腎臟切片染色 取部分腎臟用10%中性甲醛固定，常規脫水、浸蠟、包埋，將各組大鼠腎臟組織石蠟橫斷面連續切3片，厚度約每片5 μm，切片常規脫蠟去水。然后嚴格按照步驟進行HE和Masson染色，在光學顯微鏡下觀察病理變化。以Masson染色結果為對象，用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像進行分析，計算高倍鏡視野中被染成藍色的纖維組織面積與視野總面積的比值，得到纖維化面積所占比率。再采用Katafuchi等[14]方法半定量分析腎間質纖維化程度：無纖維化，0分；纖維化面積所占比率<25%，1分；25%～50%，2分；<50%，3分。

2.5RT-PCR法檢測腎臟組織TNF-α、MIF和CD68 mRNA的變化 進行半定量PCR分析，評估腎臟組織TNF-α、MIF和CD68 mRNA表達情況。以β-actin作為內參照，針對TNF-α、MIF和CD68特異性序列設計PCR引物(表1)。使用RNA提取試劑盒提取RNA，以各組腎臟總RNA逆轉錄的cDNA為模板，RT-PCR分析TNF-α、MIF和CD68 mRNA表達情況。

表1 引物序列

3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠體重、腎重及腎重指數的變化

與A組比較，B組大鼠體重明顯下降(P<0.01)，腎重和腎重系數明顯上升(P<0.01)。與B組比較，D組大鼠體重增加不明顯(P>0.05), C、E和F組大鼠體重增加(P<0.01或P<0.05)；C、D組大鼠腎重下降不明顯(P>0.05)，E、F組大鼠腎重下降(P<0.05)；C、D、E和F組大鼠腎重系數下降(P<0.01或P<0.05)。與C、D兩組單用藥比較，葛根素聯用沙格列汀組在增加體重和降低腎重、腎重系數方面更明顯，見表2。

表2 各組大鼠體重、腎重及腎重指數

2 葛根素聯用沙格列汀對大鼠血糖和HbA1c的影響

與A組比較，B組大鼠血糖和HbA1c明顯升高(P<0.01)。與B組比較，各治療組的血糖和HbA1c都有不同程度的下降(P<0.01或P<0.05)。葛根素聯用沙格列汀可以有效降低血糖和HbA1c，比單用葛根素效果更好，但與沙格列汀聯用二甲雙胍組之間無顯著差異，見表3。

表3 各組大鼠血糖和HbA1c

3 葛根素聯用沙格列汀對大鼠血清中TNF-α和MIF的影響

與A組比較， B組大鼠血清中TNF-α和MIF水平都明顯上升(P<0.01)。與B組比較，各治療組大鼠血清中TNF-α和MIF水平下降(P<0.01或P<0.05)。與單給藥組比較，葛根素聯用沙格列汀降低TNF-α和MIF在血清中的含量更為明顯。與二甲雙胍聯用沙格列汀治療組相比，葛根素聯用沙格列汀有進一步降低TNF-α和MIF含量的趨勢，但差異沒有統計學意義，見表4。

表4 各組大鼠血清中TNF-α和MIF的含量

4 各組大鼠腎組織的病理學觀察

顯微鏡下，HE染色顯示， A組大鼠腎小球體積正常，系膜細胞無增生。B組大鼠腎小球體積增大，腎小球內系膜細胞數增多，腎小管出現明顯空泡和腫脹。各治療組腎組織病理變化與B組比較均發生不同程度的減輕，葛根素聯用沙格列汀與單用藥物組比較，改善作用更加明顯。Masson染色結果顯示，A組大鼠腎間質未觀察到明顯的膠原纖維，腎小球、腎小管基底膜染成藍色，染色較淺。B組大鼠腎間質中有明顯的膠原纖維，基質增多，染色加深。與B組比較，各治療組纖維化均有不同程度改善，其中，聯合用藥組較單用藥組改善程度更加明顯。半定量分析表明，B組腎間質纖維化積分值明顯高于A組(P<0.01)；與B組比較，各治療組積分值降低(P<0.05或P<0.01)。相比于單用藥，聯合用藥改善程度更加明顯，但2個聯合用藥組之間差異不明顯，見圖1、表4。

Figure 1. Renal tissue with HE and Masson staining in all groups. A: normal control group; B: diabetic model group; C: puerarin treatment group; D: saxagliptin treatment group; E: puerarin combined with saxagliptin treatment group; F: metformin combined saxagliptin treatment group.

5 葛根素聯用沙格列汀對腎臟TNF-α、MIF及CD68 mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示，與A組大鼠相比，B組大鼠腎臟中TNF-α、MIF及CD68 mRNA都具有較高的表達。與B組大鼠相比，各治療組大鼠TNF-α、MIF及CD68 mRNA表達均下降。與單用藥組大鼠比較，葛根素聯用沙格列汀組大鼠TNF-α、MIF及CD68 mRNA表達下降更顯著，見圖2。

Figure 2. The mRNA expression of CD68, MIF and TNF-α in the kidneys of all groups. A: normal control group; B: diabetic model group; C: puerarin treatment group; D: saxagliptin treatment group; E: puerarin combined with saxagliptin treatment group; F: metformin combined with saxagliptin treatment group.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs A; #P<0.05 vs B.

討 論

糖尿病腎病是糖尿病的嚴重并發癥，也是導致慢性腎功能衰竭的主要原因之一。腎臟肥大是糖尿病腎病早期病理變化的主要表現[2]，到晚期時發展為腎小球硬化、腎小管萎縮以及腎間質纖維化，最終導致腎功能衰竭。腎間質纖維化是幾乎所有原發性和繼發性腎病發展到終晚期腎衰竭的共同途徑。因此，防止和緩解糖尿病腎病發生與發展，尋求有效控制糖尿病腎臟纖維化的藥物成為研究重點。

TNF-α是引起腎臟損傷的重要因子之一，是與腎臟纖維化聯系最密切的炎癥因子。TNF-α是單核巨噬細胞等分泌產生的具有多種生物學功能的細胞因子，它導致糖尿病腎病的生物學特性有：(1) 刺激系膜細胞產生氧自由基、前列腺素、白三烯等炎癥介質，導致微血管損傷從而引起腎臟纖維化的發生[15]；(2) 間接刺激巨噬細胞，誘導其釋放部分細胞炎癥介質；(3) 抑制胰島素信號傳遞，引起胰島素抵抗[16]。這些變化都能夠導致腎臟纖維化的發生與發展。

巨噬細胞是一種炎癥細胞，它在腎組織部位聚集、浸潤，能夠分泌各種炎癥因子，如TNF-α和IL-1，加劇炎癥，進而導致腎間質纖維化和腎小球硬化[17]。MIF也是巨噬細胞釋放的一種炎癥細胞因子，并且能夠反作用于巨噬細胞，抑制巨噬細胞的移動，使其固定在腎組織炎癥部位，促使其增殖、釋放更多的TNF-α 等炎癥趨化因子。因此，在腎組織MIF增多的區域會發現大量巨噬細胞的堆積，進而促進腎間質纖維化[18]。

本實驗采用高糖高脂+STZ誘導2型糖尿病大鼠模型，選用天然藥物葛根素與沙格列汀聯用。本研究顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠血清中MIF與TNF-α的含量顯著升高，腎臟中TNF-α、MIF和CD68 mRNA表達顯著升高。據此推測，TNF-α、MIF和CD68 mRNA表達在糖尿病大鼠腎臟中的上升可能是糖尿病腎病的發病機制之一，這也與相關研究發現的糖尿病腎病形成的分子機制相同[2]。沙格列汀是一種高效DPP-4抑制劑，通過選擇性抑制DPP-4來調節血糖，是一類新的降糖藥。本實驗結果顯示，沙格列汀降低血糖與HbA1c，這與Auqeri等[19]報道的結果一致。本實驗結果還顯示，沙格列汀可降低血清中的MIF和TNF-α含量，下調腎臟中的TNF-α、MIF和CD68 mRNA表達。當葛根素聯用沙格列汀時，以上指標下降的程度更加明顯。

總之，葛根素聯用沙格列汀對糖尿病大鼠腎臟纖維化具有改善作用，其機制可能與降低血糖、下調腎臟中TNF-α、MIF和CD68 mRNA表達有關。

[參 考 文 獻]

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