miR-155種子序列的反義寡核苷酸對抗多發性骨髓瘤的作用*

豐茂曉， 朱容萱， 駱小闖， 古春明， 曾 雪， 費 嘉△

(暨南大學醫學院 1生物化學與分子生物學系, 2臨床醫學系，廣東 廣州 510632)

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是惡性漿細胞克隆性增殖疾病，其發病機制涉及多個方面，包括染色體數量異常、易位、基因突變、表觀遺傳學改變以及骨髓微環境的改變[1]。多發性骨髓瘤發病呈現多步驟的過程，早期的染色體易位涉及到14號染色體(14q32.33)和4號染色體(4p16.3)，結果導致4號染色體上相鄰的多發性骨髓瘤組蛋白(multiple myeloma SET protein，MMSET)基因和成纖維細胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptors 3，FGFR3)基因發生分離[2]。隨著疾病的發展，將再次發生染色體易位、相關基因的突變(涉及到K-RAS和N-RAS的激活)、復雜核型畸變、p53和FGFR3基因的突變以及細胞周期素依賴性激酶抑制劑2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A)和細胞周期素依賴性激酶抑制劑2C(cyclin-dependent kinase inhibitor 2C,CDKN2C)基因的失活[2]。這些遺傳畸變將導致惡性漿細胞黏附分子表達的改變，必然引起漿細胞和骨髓基質的異常作用[2]，進而引起人骨髓微環境(human bone marrow microenvironment, huBMM)中的漿細胞發生多級轉變，這些轉變對腫瘤細胞生長、存活和耐藥性有著重要的影響[3-5]。隨著研究的深入，發現MM細胞中的miRNAs呈顯著的異常表達，并認為這些異常表達的miRNAs與漿細胞發生遺傳學畸變，特別是與染色體異常有密切的關聯[2,6-7]。

Al Masri等[8]的研究發現在細胞系和病人的骨髓樣本中，惡性的漿細胞miRNA的表達水平出現明顯的差異，其中高表達的miRNAs包括miR-125b、miR-133a、miR-1和miR-124a。Bakkus等[9]也檢測出MM病人以及細胞系中一些高表達的miRNAs(let-7a、miR-16、miR-17-5p和miR-19b)。Picchiorri等[10]還發現，miRNA-17～92群(miRNA-19a、-19b和-92)和miRNA-106～25 群(miRNA-106b、-93和-25)在MM樣品中也呈現高表達的現象，miRNA-17～92通過靶向負性調節凋亡前體蛋白Bim的表達，有助于骨髓瘤的形成。Lane等[11]對MM樣品中異常表達的miRNA 進行分析，結果發現miRNA-21、miR-19a和miR-19b表達水平升高，并揭示這些miRNAs參與信號轉導子及轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)和白細胞介素 6(interleukin-6, IL-6)的抗凋亡途徑。根據染色體易位和周期蛋白D (translocation/cyclin D, TC)分類，Lionetti等[6]通過多重分析發現MM在5個TC組中有26個miRNAs具有顯著表達差異現象，其中值得注意的是在TC5組中有10種miRNAs相比于其它4個TC組有明顯的過表達趨勢。在這10種過表達的miRNAs中，miR-155在MM中高水平表達首次被發現。 目前已知miR-155在B細胞淋巴瘤中是一個重要的生物標志物，有關miR-155在惡性漿細胞病中的功能還沒有文獻報道。由于漿細胞也是來源于B細胞，因此，miR-155在MM中是否具有類似B細胞淋巴瘤中癌基因功能，這引起我們極大的關注。

miRNA是一類內源性，約22個核苷酸長度的非編碼小RNA，通過轉錄后負性調控機制在細胞過程中起著重要的作用。成熟的miRNA與靶mRNA的3’非翻譯區(3’-untranslated region，3’UTR)配對，從而抑制翻譯過程或降解靶mRNA。這些小分子RNA也可能在腫瘤形成過程中起重要作用[12]，類似癌基因(oncomiRs)功能，因此oncomiRs被當作為癌癥治療新的靶點[13]。另一方面，在miRNA的5’端具有7～8個高度保守序列，被稱為種子序列。種子序列通過與其靶基因mRNA的3’UTR進行堿基完全互補配對，促進靶基因mRNA降解或抑制mRNA翻譯，從而對靶基因的表達水平進行轉錄后的負性調控[14-16]。針對miRNA種子序列反義核酸可以干擾miRNA與靶基因的配對，從而阻止miRNA發揮功能。相對于成熟miRNA而言，針對種子序列的反義核酸具有分子量小、特異性強、轉染效率高等優點，因而開始受到關注[17]。

為了闡述miR-155在多發性骨髓瘤細胞中的作用，本研究針對miR-155的種子序列合成miR-155的微小反義核酸(tiny antimiR-155, t-antimiR-155)，靶向作用于多發性骨髓瘤細胞RPMI-8266中的miR-155，探究t-antimiR-155對多發性骨髓瘤細胞的抑制效應，為腫瘤基因治療尋找新的方法，同時也為針對miRNA種子序列的反義核酸藥物開發創造有利條件。

材 料 和 方 法

1 反義寡核苷酸的設計與合成

從microRNA Families數據庫中獲取人miR-155的種子序列，根據序列互補原理設計針對種子序列的反義寡核苷酸序列(t-antimiR-155)，并采用BLAST軟件分析確定其反義寡核苷酸序列及隨機對照序列，見圖1。

Figure 1. The sequences of miR-155 and t-antimiR-155.

2 主要試劑

MTT和DMSO購自Sigma；胎牛血清及RPMI-1640培養基購自Gibco；LipofectamineTM2000購自Invitrogen。反義寡核苷酸序列(t-antimiR-155)：5’-AGCATTAA-3’；隨機序列(scrambled sequence，SCR)：5’-TCATACTA-3’，均由上海生物工程有限公司合成，全硫代修飾，高效液相色譜(high-performance liquid chromatography, HPLC)純化。

3 主要方法

3.1細胞培養 將RPMI-8266細胞(多發性骨髓瘤細胞，南方醫科大學附屬珠江醫院惠贈)接種于含10%胎牛血清、無抗生素的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱，飽和濕度下培養。每2～3 d換液傳代。實驗選用對數生長期、0.2%臺盼藍拒染率>95%的細胞。

3.2MTT法篩選反義寡核苷酸的最佳作用濃度 本實驗分t-antimiR-155組、SCR組和空白對照組，每組設5個復孔。t-antimiR-155組中t-antimiR-155的核酸終濃度為0.2、0.3、0.4 和0.5 μmol/L，SCR組中隨機序列的核酸終濃度為0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L。取對數生長期的RPMI-8266細胞，各組細胞以1×108cells/L的密度接種于96孔板，每孔50 μL，轉染終體積100 μL(轉染方法參照Invitrogen公司LipofectamineTM2000說明書)，空白對照組加入50 μL無血清Opti-MEM培養基。轉染6 h后，每孔加入100 μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養基，使每孔終體積為200 μL。48 h后每孔加入MTT液20 μL，于培養箱中培養4 h后，1 000 r/min離心10 min，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶充分溶解。在多功能酶標儀上測定吸光度A570。實驗重復3次，計算增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%。

3.3甲基纖維素細胞集落培養實驗觀察細胞集落形成情況 實驗分組同前，根據文獻改進[11]，取對數生長期的RPMI-8266細胞，按1×103cells/well接種于含20%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、5 μmol/L β-疏基乙醇和0.9%甲基纖維素的半固體培養基中，置37 ℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養7 d。倒置顯微鏡下計數集落數和觀察集落形態，以大于40個細胞的細胞團為1個集落。實驗重復3次，計算相對集落形成率=(實驗組/空白對照組)×100%。

3.4流式細胞儀計量分析RPMI-8266細胞凋亡情況 實驗分組同前，各組細胞以5×107cells/L的密度接種于24孔板，每孔400 μL，轉染終體積500 μL，空白對照組加入與實驗組同體積的RPMI-1640培養基。6 h后加入500 μL 含20%胎牛血清的RPMI-1640培養基置于培養箱中培養。反義寡核苷酸組和隨機對照組的核酸終濃度為0.4 μmol/L。48 h后離心收集細胞，采用Annexin V/PI二重染色，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，使用SPSS 13.0統計軟件，采用單因素方差分析法(one-way AVONA)分析各組數據差異的顯著性。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MTT法篩選反義寡核苷酸最佳作用濃度

t-antimiR-155在0.2 μmol/L和0.4 μmol/L之間有效抑制RPMI-8266細胞增殖活性，其最佳作用濃度為0.4 μmol/L，與SCR組相比差異顯著(P<0.05)。t-antimiR-155在0.5 μmol/L的濃度顯示出非特異性作用，見圖2。

Figure 2. Inhibition rate of RPMI-8266 cells after transfected with t-antimiR-155.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs SCR group.

2 反義寡核苷酸對細胞集落形成的影響

采用甲基纖維素為支持物的集落形成法(colony forming method)檢測RPMI-8266細胞的自我更新和增殖能力。7 d后，與SCR組相比，0.4 μmol/L反義寡核苷酸作用于RPMI-8266細胞后，細胞集落形成能力較弱,集落形成抑制率較高，差異顯著(P<0.05),見圖3。

3 反義寡核苷酸對細胞凋亡的影響

0.4 μmol/L反義寡核苷酸作用于RPMI-8266細胞48 h后，經Annexin V/PI二重染色，流式細胞術檢測細胞凋亡率為7.56%。與SCR組相比，其凋亡率明顯增加(P<0.05)，見圖4。以上實驗結果表明t-antimiR-155作用于RPMI-8266細胞后，細胞生長受到抑制，細胞凋亡明顯增加。

Figure 3. Cell colony formation assay of RPMI-8266 cells.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs SCR.

Figure 4. Flow cytometry analysis of the apoptosis of RPMI-8266 cells.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs SCR.

討 論

多發性骨髓瘤是起源于漿細胞的惡性克隆增殖性疾病，以血清或尿液中出現單克隆免疫球蛋白以及多器官功能損害為特征，約占血液系統惡性腫瘤的10%。常規化療緩解率低，迄今難以治愈[18-19]，因此，需要尋找新的治療手段。

miR-155位于21號染色體上，參與人體造血、炎癥和免疫等功能[6]。作為一個類似癌基因， miR-155在多個腫瘤中高水平表達[20]，與白血病、乳腺癌、肺癌、胃癌的形成過程都有密切的關系[21]。在華氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom macroglobulinemia，WM)中，失調的miR-155通過調節絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt和核因子κB信號通路，影響WM細胞生存和生長[22]；通過敲除miR-155，導致位于G1期的WM細胞明顯降低，同時導致細胞周期依賴激酶和細胞周期蛋白D下調并刺激p53蛋白過表達。這意味著miR-155在WM細胞中通過調節細胞周期蛋白導致G1期阻滯[22]。雖然WM和MM一樣，也是漿細胞病的一種，但miR-155在MM中確切的功能還不清楚。

基于文獻報道miR-155在MM中的高水平表達[6]，可能具有類似癌基因的作用，本研究針對miR-155的種子序列合成反義寡核苷酸t-antimiR-155，研究其在多發性骨髓瘤中的抑制作用。我們的數據顯示t-antimiR-155經脂質體轉染，顯著抑制RPMI-8266細胞的增殖，其最佳作用濃度為0.4 μmol/L(圖2)。其他的研究揭示乳腺癌中miR-155靶基因編碼的蛋白是轉錄因子FOXO3a(forkhead box O3a)，涉及細胞的存活[23]。同時，Linnstaedt等[24]也證實在大細胞淋巴瘤和彌散性大B細胞淋巴性淋巴瘤中，抑制miR-155的水平也可以抑制細胞的生長，與我們的結果一致。本研究首次采用了克隆形成實驗來研究t-antimiR-155對RPMI-8266細胞惡性程度的影響，數據顯示t-antimiR-155可以降低RPMI-8266細胞集落形成的能力(圖3)，有效抑制RPMI-8266細胞的惡性進展。流式細胞術檢測結果顯示t-antimiR-155可以明顯促進RPMI-8266細胞的凋亡(圖4)。

在體內和體外實驗中，針對于mRNA的反義核苷酸已經被廣泛用于評價靶基因的功能[25]，同時有些反義核酸治療方法已經用于臨床實驗[25-26]，反義核苷酸藥物具有安全性高、易合成、直接抑制靶基因表達等優點。miRNA反義核苷酸也是根據堿基互補配對原理，化學或生物合成與特定的miRNA初級轉錄物、miRNA前體或成熟的miRNA互補的DNA或RNA序列。在細胞中miRNA反義DNA與靶miRNA形成miRNA-DNA雜化鏈，激活RNA酶H，引起miRNA的降解，從而達到基因控制和治療的目的。由于成熟miRNA只有19～24個核苷酸，目前認為用反義核苷酸抑制它們的功能是最好、也可能是唯一的方法[27]。

反義核苷酸技術在實際應用中也存在一些不容忽視的問題，比如高濃度藥物也有一定的毒副作用，與靶序列的親和力低，特別是藥物在體內易被降解以及向靶器官傳遞效果不佳等制約了反義藥物開發的進程等。對反義寡核苷酸進行一系列的化學修飾，可以增加反義寡核苷酸的親和力，提高其抗性和在體內的輸送效率。提高反義寡核苷酸與靶RNA親和力的修飾涉及糖環部分，常用的修飾方法有鎖核苷酸(locked nucleic acid, LNA)修飾、2′-O-甲基(2′-O-methyl)修飾、2′-O-甲氧乙基(2′-O-methoxyethyl)修飾、2′-氟代(2′-fluoro)修飾，而在這些修飾中提升與互補RNA親和性最佳的為LNA修飾，可使雙聯熔解溫度(Tm)上升2～8 ℃[28]。另一方面，通過對反義寡核苷酸骨架的硫代修飾和嗎啉代修飾，可以提高反義寡核苷酸抗性和體內的輸送效率[28]。我們設計合成的miR-155種子序列的反義寡核苷酸進行了全硫代修飾，本文中缺少對miR-155沉默的直接實驗驗證，這是本文章的不足之處，將作為我們今后進一步研究的內容。

目前，有關于miR-155的反義寡核苷酸經過LNA修飾可以沉默miR-155的報道。他們選用miR-155的多個靶基因做成熒光報告基因，用來檢測miR-155是否被沉默。檢測的結果顯示，經過LNA修飾的antimiR-155可以使miR-155的多個靶基因(SOCS1、SMAD5、CEBPβ、MAFB、SHANK2和SH3PXD2A)的表達量明顯增加[29]。由于全硫代修飾的t-antimiR-155的序列和t-LNA-155的序列相同，從理論上看，他們的生物學功能應當是相似的。

我們雖然沒有通過檢測miR-155的靶基因來獲得全硫代修飾的t-antimiR-155沉默miR-155的直接實驗證據，但在我們以前的研究中，將miR-21的靶基因程序性細胞死亡4(programmed cell death 4,PDCD4)做成熒光報告基因，轉染硫代修飾的anti-miR-21后，PDCD4的熒光活力明顯比SCR和空白組要高[30]。此結果可以證明經過全硫代修飾的反義寡核苷酸同樣也可以使靶miRNA沉默。

本研究顯示miR-155在多發性骨髓瘤中具有重要的類似癌基因的作用，針對種子序列的t-antimiR-155顯著抑制多發性骨髓瘤的進展，可用于腫瘤的實驗治療研究，有一定的藥物開發前景。

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