干擾IDH-2基因?qū)π〖毎伟┥L抑制作用的研究

陸建紅， 陳國軍， 董長林， 郭紹文， 金益軍△

(1武警浙江總隊醫(yī)院檢驗科，浙江 嘉興 314000； 2上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院病理科，上海 200130)

異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)家族借助 NAD 或NADP 作為輔助因子，催化異檸檬酸的氧化脫酸反應, 生成α-酮戊二酸的酶類，同時分別生成 NADH 或 NADPH[1]。IDH 分為 3個亞型, 其中 IDH-2 在能量代謝和細胞氧化損傷反應中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中 IDH-2 發(fā)生突變。目前 IDH-2 在急性髓細胞白血病、骨髓增殖性腫瘤、膠質(zhì)瘤[2-3]等疾病中研究較為集中，發(fā)現(xiàn)密碼子 R140 和 R172 的精氨酸被其它氨基酸替代，使細胞中α-酮戊二酸水平明顯下降、2-羥戊二酸水平增高，但 IDH-2在小細胞肺癌中作用的研究國內(nèi)外鮮有報道。本研究利用RNA 干擾技術抑制人小細胞肺癌細胞 NCI-H446 中IDH-2表達，探討 IDH-2 在小細胞肺癌中發(fā)生與發(fā)展的作用，從而為小細胞肺癌的診斷及治療提供新的靶基因。

材 料 和 方 法

1 材料

人小細胞肺癌細胞株NCI-H446購自中國科學院細胞庫；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒 Lipofectamine 2000購自 Invitrogen；siRNA由上海吉瑪公司合成；小鼠抗人 IDH-2單抗和小鼠抗人 MAPK p42購自Cell Signal；人HRP標記的β-actin抗體購于上海康成生物工程有限公司；總 RNA提取試劑 Trizol和RT-PCR試劑盒 (TaKaRa)；Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 試劑盒購于Dojindo；Western blotting試劑盒購于Sigma；二氧化碳培養(yǎng)箱 (NU-3500)、倒置熒光顯微鏡 (Olympus)和實時定量熒光PCR儀 (ABI 7500)。

2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液 (含10% 胎牛血清，青霉素1×105U/L，鏈霉素100 mg/L)， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

培養(yǎng)NCI-H446細胞使其充分貼壁，覆蓋率達到約60%～70%。IDH-2(BC071828)特異性干擾RNA siRNA-IDH-2和無關對照siRNA-NC由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成，用 Lipofectamine 2000按說明書進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后siRNA濃度為250 nmol/L, siRNA 轉(zhuǎn)染率約達到90%。

3 主要方法

3.1Real-time PCR檢測mRNA的表達 用Trizol一步抽提法提取細胞總RNA, 用TaKaRa RT 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR綠色熒光標記試劑盒 (TaKaRa) 說明進行PCR擴增，實時定量熒光PCR儀為ABI 7500。反應程序為：95 ℃ 30 s后；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。比較閾值法計算目的基因的相對表達。

3.2Western blotting檢測蛋白的表達 細胞裂解提取蛋白后，進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5% 脫脂奶粉室溫下封閉2 h，Ⅰ抗為IDH-2或MAPK p42(1∶1 000)和 HRP標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h。

3.3CCK-8 法檢測細胞增殖 siRNA-IDH-2 和 siRNA-NC 轉(zhuǎn)染 NCI-H446細胞后，取1×107cells/L 種入 96 孔培養(yǎng)板中(100μL)，各組6個平行孔，培養(yǎng)72 h。檢測時每孔加入 100 μL CCK-8 混合液(含10 μL CCK-8試劑，90 μL培養(yǎng)液)繼續(xù)孵箱培養(yǎng)2 h，后酶標儀 450 nm 測定吸光度(A)，實驗重復3次。細胞存活率(%)=(實驗組A-空白對照A)/(NEG組A-空白對照A)×100%。

3.4細胞周期分析 選用對數(shù)生長期的 NCI-H446 細胞，以 4×108/L的細胞密度接種于 24 孔培養(yǎng)板中，各組3個平行孔。過夜后按上述方法轉(zhuǎn)染 siRNA，48 h 后收集細胞，用 4 ℃ 預冷 4% 多聚甲醛固定10 min， PBS 洗滌2次后，PI (100 mg/L)37 ℃ 孵育細胞30 min, 后流式細胞術檢測。實驗重復3次。

3.5細胞遷移實驗 NCI-H446 細胞以每孔2×105個鋪于 24 孔板，各組3個平行孔。過夜后用 siRNA 轉(zhuǎn)染，8 h 后胰酶消化,用無血清培養(yǎng)基種于孔徑為8 μm Transwell 孔中，孔底加10% FCS的培養(yǎng)液。48 h 后，用結(jié)晶紫染色，熒光顯微鏡下觀察拍照，并計算40倍目鏡下細胞個數(shù)，以對照NEG組為 100%，計算各組遷移率。實驗重復3次。

3.6動物實驗 NCI-H446 細胞鋪于6孔板，當細胞處于對數(shù)生長期時，siRNA(250 nmol/L)轉(zhuǎn)染細胞。 轉(zhuǎn)染72 h后，將 siRNA-IDH-2和siRNA-NC 2組細胞以及未處理的處于對數(shù)生長期的 NEG 組細胞一起消化計數(shù)，調(diào)整細胞密度后，分別于裸鼠背部皮下接種 1×107cells/100 μL，每組10 只，接種后在恒溫、恒濕、新鮮空氣、除塵除菌的無特殊病原菌(SPF級)飼養(yǎng)室條件下飼養(yǎng)。接種后連續(xù)觀察是否成瘤，成瘤后每周由同一測量者用游標卡尺測量腫瘤的最大直徑(a)和最小直徑(b)，按公式V=1/2ab2計算腫瘤體積。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析，多組樣本的比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 siRNA-IDH-2對 NCI-H446 細胞中 IDH-2 表達的影響

通過 real-time PCR和Western blotting分別檢測 IDH-2 mRNA和蛋白表達水平，結(jié)果顯示,siRNA-IDH-2 能夠有效地沉默小細胞肺癌 NCI-H446細胞中IDH-2的表達，與對照組和未處理 NEG 組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而對照組和 NEG 組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 見圖1。

Figure 1. The effect of siRNA-IDH-2 on the expression of IDH-2 at mRNA (A) and protein (B) levels in NCI-H446 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs siRNA-NC or NEG.

2 siRNA-IDH-2 對 NCI-H446 細胞增殖及細胞中 MAPK p42蛋白表達的影響

CCK-8方法檢測結(jié)果顯示，siRNA-IDH-2組細胞增殖明顯比siRNA-NC和NEG對照組受到抑制,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)，見圖2A。同時 Western blotting結(jié)果顯示,siRNA-IDH-2 組 MAPK p42 蛋白表達弱于對照組，見圖2B，說明是通過MAPK信號通路來抑制細胞生長的。

3 siRNA-IDH-2 對 NCI-H446 細胞周期的影響

siRNA-IDH-2處理組的 S 期細胞明顯增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖 2C。

4 siRNA-IDH-2 對 NCI-H446 細胞遷移能力的影響

與siRNA-NC組和NEG組比較，3 d 后siRNA-IDH-2組有明顯抑制細胞遷移的作用，見圖3。

5 siRNA-IDH-2對裸鼠移植瘤生長的影響

siRNA-IDH-2組中裸鼠腫瘤生長明顯緩慢，體積明顯小于siRNA-NC組和空白組(P<0.01), 而siRNA-NC組和空白組裸鼠腫瘤體積之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

討 論

肺癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤之首，其中小細胞肺癌(small-cell lung carcinoma, SCLC)是肺癌中惡性度最高的一種，約占原發(fā)性肺癌的 20%～30%，以高侵襲性及不良預后為其特征。SCLC 傳統(tǒng)治療以全身化療為主，90% 以上的患者治療后復發(fā)，5 年生存率僅 1%～3%。SCLC 預后差，迫切需要發(fā)展新的療法，針對小細胞肺癌的基因治療是其防治的一個方向，其中RNA 干擾[4-5]治療在小細胞肺癌治療中有更為廣闊的應用前景。

Figure 2. The effect of siRNA-IHH-2 on the cell proliferation(A), the protein expression of MAPK p42 (B) and the cell cycle (C) in NCI-H446 cells. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs siRNA-NC or NEG.

IDH在能量代謝、氨基酸和維生素合成中扮演重要角色，而且對該酶的活性調(diào)節(jié)將直接影響 IDH 或 IDH 底物參與不同的生物途徑、發(fā)揮不同的生物功能。完整的 IDH 活性可保護細胞免于氧化應激，而突變的 IDH 與異檸檬酸的親和力降低，且突變體催化α-酮戊二酸，最終導致α-酮戊二酸的供應減少[6-7]。α-酮戊二酸的減少又可導致促進腫瘤生長的厭氧誘導因子水平顯著升高，因而誘發(fā)腫瘤。

Figure 3. The effect of siRNA-IDH-2 on the migration of NCI-H446 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs siRNA-NC or NEG.

Figure 4. The effect of siRNA-IDH-2 on the xenograft tumors in the nude mice.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs siRNA-NC or NEG.

MAPK p42/44是維持細胞增殖的重要信號通路，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都有MAPK通路主要蛋白的遺傳性和表遺傳性活化。本研究中通過siRNA-IDH-2抑制IDH-2表達，同時抑制MAPK p42蛋白的表達，從而說明NCI-H446細胞的生長抑制是通過抑制MAPK信號通路而產(chǎn)生的。MAPK p42蛋白下調(diào)引起細胞增殖抑制，細胞周期阻滯于S期，從而引起細胞凋亡，達到良好的抑瘤作用。

目前研究證實細胞內(nèi)編碼 NADP 依賴性 IDH的IDH-1 和IDH-2亞型基因的突變可促進腫瘤發(fā)生, 且這2個基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和星狀細胞瘤等腦瘤中經(jīng)常發(fā)生突變[8]。以上成果提示，IDH-2可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。在本研究證實了在NCI-H446細胞中用siRNA特異沉默IDH-2基因后，能有效抑制NCI-H446小細胞肺癌細胞增殖和遷移能力，更重要的是在沉默IDH-2基因后能顯著抑制小鼠移植瘤的生長。

[參 考 文 獻]

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