miRNA-24對內皮型一氧化氮合酶表達調節及血管內皮細胞增殖的影響*

張文宇， 王 輝， 李玉媚， 陳 偉， 胡 楠， 歐和生

(廣西醫科大學藥學院, 廣西 南寧 530021)

微小RNA(miRNA)是長約22 nt的一類高度保守的內源性非編碼單鏈小RNA，其通過序列特異性方式調控mRNA的降解或抑制蛋白質翻譯。約有30%人類基因的表達受到miRNAs的精細調控[1]。近年來研究表明，某些miRNAs參與血管內皮細胞分化、增殖與凋亡的過程[2-3]；更重要的是，這類miRNAs不但與內皮細胞的生理功能密切相關，而且參與心血管疾病的發生與發展[4-5]。

內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)作為限速酶介導內皮細胞生成NO，后者在維持血管正常舒張功能、內皮損傷后的修復以及血小板聚集的抑制等方面起著至關重要的作用[6-8]。人類eNOS基因位于7q35～36，其核心啟動子區域包含多個順式作用元件，其中就包括了一些核轉錄因子的高親和力結合位點，例如Sp1。作為重要的核轉錄因子，Sp1通過增強eNOS基因的轉錄活性誘導內皮細胞增殖[9]。令人感興趣的是， 新近有研究提示miRNA-24參與Sp1的表達調控[10]。為探討miRNA-24 對內皮細胞增殖的影響及其對eNOS表達調控作用，本實驗利用脂質體將構建的miRNA-24高表達質粒轉染人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)，觀測HUVECs的增殖情況，并檢測核轉錄因子Sp1與eNOS mRNA及蛋白表達的變化情況。

材 料 和 方 法

1 材料

人類臍靜脈內皮細胞購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)；改良型RPMI-1640 細胞培養基[海克隆生物化學制品(北京)有限公司]；Gibco 公司胎牛血清(天津灝洋生物有限公司)；載體miRNASelectTMpEGP-miR(Cell Biolabs)；質粒提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；LipofectamineTM2000 轉染試劑盒(Invitrogen)；總RNA 提取試劑盒(TRIzol法；北京百泰克生物技術有限公司)；RT試劑盒(MBI)；PCR 試劑盒(天根生化科技有限公司)；引物合成及Sp1高表達質粒[寶成生物工程(大連)有限公司]；eNOS兔源單克隆抗體(Cell Signaling)。

2 方法

2.1miRNA-24的構建和鑒定 miRNA-24序列(來自http://www. miRbase.org)為5’-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3’；通過DNA合成技術得到第1鏈DNA，利用DNA連接反應合成相應的雙鏈DNA，最后將擴增后體外重組的DNA插入pEGP-miR載體轉化入E.coliDH5α宿主菌，將1.5 mL菌液(經酶切初步證實插入正確的單克隆菌落)提取質粒DNA寄上海生工進行DNA 序列測定。

2.2HUVECs的培養和轉染 HUVECs用含有1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中。選用LipofectamineTM2000脂質體作為介質，轉染4 h后更換含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，培養24 h觀察免疫熒光。根據轉染質粒將實驗細胞分為miRNA-24表達組、 miRNA-24抑制(anti-miRNA-24)組和質粒對照組。

2.3MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期的HUVECs至96孔板，分別在每孔接種2×103個細胞，待細胞達到50%融合時更換無血清培養基培養24 h實現細胞同步生長。分別于不同時段加入MTT繼續培養4 h，使用酶聯免疫檢測儀在570 nm的波長下測定吸光度，按生長抑制率(%)=(1-實驗組A570值/對照組A570值)×100% 的公式計算細胞生長抑制率。

2.4免疫組化檢測轉染前后eNOS和Sp1的表達 將無菌玻片放入24孔板，加入細胞(每孔2×104個HUVECs)培養24 h，更換轉染劑培養4 h，轉染成功后取爬片，PBS沖洗3次，中性樹脂粘片，4%甲醛固定。用TritonX-100(10 min)和3%過氧化氫(30 min)處理后雙蒸水沖洗3次，敷Ⅰ抗、Ⅱ抗后顯色劑顯色。

2.5RT-PCR檢測轉染前后eNOS和Sp1 mRNA的表達 按照TRIzol試劑盒說明書提取各實驗組的細胞總RNA。利用Primer 5.0軟件設計合成人eNOS、Sp1以及β-actin的引物，序列見表1。 取細胞總RNA 1 μg，加入1.0 μL(0.5 g/L)Oligo(dT)18引物，70 ℃變性5 min，迅速置于冰上冷卻。加入4 μL 5×reaction buffer，1 μL RiboLockTMRibonuclease Inhibitor (20 U/μL)，2 μL 10 mmol/L dNTP Mix，37 ℃溫育5 min，加入1 μL 逆轉錄酶，42 ℃ 1 h，之后70 ℃ 10 min終止反應，合成cDNA第1條鏈。PCR 擴增反應：94 ℃預變性5 min后，開始30 個循環：94 ℃ 30 s、56 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min；最后72 ℃ 5 min，終止反應。取5 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 引物序列

2.6Western blotting檢測eNOS和Sp1蛋白的表達 將成功轉染的細胞裂解，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清。各實驗組分別取蛋白30 μg進行SDS-PAGE(8%)分離并轉至PVDF膜上。經脫脂奶粉封閉1 h后加入eNOS和Sp1 Ⅰ抗過夜(4 ℃)。TBST沖洗3次(每次10 min)，加入Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標記)孵育，1 h后重復用TBST沖洗(方法同上)。利用LI-COR公司的Odyssey紅外熒光掃描成像系統分析。

3 統計學處理

實驗重復3次，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0統計軟件進行t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miRNA-24對HUVECs增殖的影響

與對照組比較，miRNA-24表達組細胞數目72 h明顯減少54.06% (7.97±0.15vs17.35±0.40,P<0.01)，miRNA-24抑制組細胞數目降低29.56% (12.22±0.22vs17.35±0.40,P<0.01)；而與miRNA-24表達組比較，miRNA-24抑制組細胞數目則增加34.77%(12.22±0.22vs7.97±0.15,P<0.01)。轉染12 h、24 h及48 h后的結果與上述結果類似，見圖1。

Figure 1. Effect of miR-24 on endothelial cell growth. The number of endothelial cells was obtained by blood cell counting chamber.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group.

用MTT法分別檢測以上3組細胞在轉染后不同時間段細胞增殖的情況如圖2所示，miRNA-24表達組細胞增殖明顯受到抑制，72 h miRNA-24表達組的細胞抑制率最大，與對照組相比降低41.97%(0.47±0.04vs0.81±0.03,P<0.05)，miRNA-24抑制組降低17.28%(0.67±0.04vs0.81±0.03,P<0.05)。結果表明，miRNA-24參與抑制HUVECs的增殖。

Figure 2. Effect of miR-24 on the proliferation of endothelial cells measured by MTT assay at different time points (12 h, 24 h, 48 h and 72 h). Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.

2 miRNA-24對eNOS蛋白表達的影響

免疫組化的結果判定是以棕黃色為陽性，eNOS蛋白表達于細胞漿，eNOS蛋白表達量以對照組最高而miRNA-24表達組則最低，見圖3。Western blotting的檢測結果顯示，與對照組比較，miRNA-24表達組的eNOS蛋白表達量下降71.92% (0.16±0.06vs0.57±0.08，P<0.05)，miRNA-24抑制組下降36.84%(0.36±0.07vs0.57±0.08，P<0.05);而與miRNA-24表達組比較，miRNA-24抑制組增加55.56%(0.36±0.07vs0.16±0.06)。以上實驗結果顯示，miRNA-24對eNOS蛋白表達有影響，見圖4。

Figure 3. Effect of miRNA-24 on the protein expression of eNOS (immunohistochemical staining,×400).1: control; 2: miRNA-24 inhibitor; 3: miRNA-24. The protein of eNOS was showed in color of brown by the arrows.

Figure 4. Effect of miR-24 on the protein expression of eNOS detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.

3 miRNA-24對eNOS mRNA水平的影響

與對照組比較，miRNA-24高表達組的eNOS mRNA表達量降低44.8% (0.48±0.01vs0.87±0.03，P<0.05)，miRNA-24抑制組的eNOS mRNA表達量降低21.8%(0.68±0.02vs0.87±0.03，P<0.05)，miRNA-24抑制組則比高表達組增加29.4%(0.68±0.02vs0.48±0.01，P<0.05)，見圖5。結果顯示，miRNA-24抑制eNOS的轉錄。

Figure 5. The effect of miRNA-24 on the mRNA expression of eNOS measured by PT-PCR.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.

4 miRNA-24對Sp1蛋白表達的影響

對照組Sp1的表達量最高，相反，miRNA-24表達組的Sp1表達量最低。通過Western blotting對Sp1蛋白表達量進行分析，miRNA-24表達組轉錄因子Sp1的表達量比對照組下調58.1%(0.13±0.07vs0.31±0.09，P<0.05)；miRNA-24抑制組轉錄因子Sp1的表達量比對照組下調22.6% (0.24±0.06vs0.31±0.09，P<0.05)，與miRNA-24表達組比較，抑制組蛋白表達量則增加45.8%(0.24±0.06vs0.13±0.09，P<0.05)，見圖6、7。結果顯示，miRNA-24明顯抑制轉錄因子Sp1的表達。

Figure 6. Effect of miR-24 on the protein expression of Sp1 (immunohistochemical staining,×400). 1: control; 2: miR-24 inhibitor; 3: miR-24. The protein expression of Sp1 was showed in color of brown by the arrow.

Figure 7. Effect of miR-24 on the protein expression of Sp1 detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.

4 miR-24對Sp1 mRNA表達的影響

與對照組比較，miRNA-24高表達組的Sp1 mRNA表達量降低53.00%(0.45±0.02vs0.93±0.01，P<0.05)，miRNA-2抑制組的 Sp1 mRNA表達量降低33.33%(0.62±0.03vs0.93±0.01，P<0.05)，miRNA-24抑制則比高表達組增加29.00%(0.62±0.03vs0.93±0.01，P<0.05)，見圖8。結果顯示，miRNA-24抑制Sp1的轉錄。

Figure 8. Effect of miR-24 on the mRNA expression of Sp1 measured by PT-PCR.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs control group.

討 論

本文通過研究miRNA-24對eNOS表達及血管內皮細胞增殖的影響，主要有以下3個方面的發現：首先，eNOS基因是miRNA-24調控的重要分子靶標，miRNA-24對調控eNOS的表達具有明顯的調節作用；其次，miRNA-24抑制eNOS表達的同時，也抑制血管內皮細胞的增殖；第三，轉錄因子Sp1可能作為一個重要因子與miRNA-24對eNOS的表達和血管內皮細胞的增殖的調節。據我們所知，這是第1次報道miRNA-24參與內皮特異性基因eNOS的表達調控; 同時，核轉錄因子Sp1作為重要的調節分子與miRNA-24共同參與對eNOS的表達調控。

作為生成NO的關鍵酶，eNOS具有組織特異性，即主要在血管內皮細胞中表達，其表達異常與許多心血管系統疾病的發生發展密切相關[11-12]；而眾多的研究表明，miRNA的特異性改變參與了人類重大疾病(如癌癥、糖尿病、心血管疾病等)的發生發展進程[13]。因此，miRNA是否對eNOS的表達有調節作用，以及是否對血管內皮細胞的生理功能產生影響，是一個很重要的研究課題。Wang等[14]在2008年發現敲除miRNA-216的小鼠出現血管破裂、出血甚至部分胚胎死亡，其原因在于血管完整性的破壞以及內皮細胞增殖和遷移能力的改變；miRNA-132通過抑制p120 RASGAP的表達，實現對內皮細胞增殖、生存與移行的調節[15]。此外，miRNA-223作為另外一個抗血管新生的miRNA，可以通過結合于整合素β1部分抑制內皮細胞增殖[16]。氧化應激時，miRNA-24過表達于血管內皮細胞，通過furin-TGF-β通道miRNA-24參與心肌的纖維化過程,此外，miRNA-24可以減少缺血、缺氧條件下的細胞凋亡并改善心肌梗死引起的心臟重塑[17]。本研究發現，miRNA-24高表達組內皮細胞增殖速度降低，eNOS蛋白顯著減少，而miRNA-24抑制組則與高表達組相反，這一結果強烈提示，miRNA-24參與內皮特異性eNOS基因調控，并抑制HUVECs增殖。值得注意的是，大多數miRNAs通常是在轉錄水平抑制或者降解靶基因，然而我們的前期研究發現，一些內含子源性的miRNAs可能在轉錄水平對基因的表達進行調控[18]。因此，我們進一步對eNOS mRNA改變情況進行檢測，結果顯示，eNOS mRNA的表達被miRNA-24明顯抑制，這提示，miRNA-24可能在eNOS基因轉錄的階段就對其進行了調控；這一過程可能與一些核轉錄因子有關，如Sp1。

血管內皮細胞的增殖在許多心血管疾病的病理生理過程都起著十分重要的作用[19-20]。eNOS表達的改變與相關心血管疾病的發生緊密相關。有證據顯示，miRNA與核轉錄因子作為2類主要的反式作用因子，在調控真核細胞基因組的過程中有著廣泛的聯系[21-22]。定位于7q35～36的eNOS基因，其啟動子下游區域有許多與其轉錄密切相關的順式作用元件，尤其是-104位到-95位的正向調控區Ι則是轉錄因子Sp1的高親和位點[7]。本研究還發現，核轉錄因子Sp1伴隨著miRNA-24的高表達而降低。Sp1作為結合于eNOS增強子元件的重要轉錄因子[23]增強eNOS啟動子的活性，促進eNOS的轉錄，隨著HUVECs轉染了miRNA-24高表達質粒以后，eNOS表達減少，內皮細胞增殖減慢，Sp1表達量也下降，這說明Sp1參與了miRNA-24對eNOS表達的調控，我們推測其可能的分子機制是核轉錄因子Sp1表達量的減少，影響了其正向調控eNOS表達以及NO的合成，最終導致內皮細胞的增殖受到抑制。

根據生物信息學分析顯示，Sp1與miRNA-24之間也存在互補序列。這提示Sp1可能就是miRNA-24的分子靶標，我們進一步通過RT-PCR檢測3個實驗組中Sp1 mRNA的表達情況，發現miRNA-24能明顯抑制Sp1 mRNA的表達，而miRNA-24抑制物則能夠部分抵消這種效應。值得指出的是，由于Sp1和eNOS都是miRNA-24的靶標，在邏輯上， miRNA-24的抑制物似乎能完全抵消二者對細胞增殖的調節；然而本實驗的結果顯示， miRNA-24抑制物只能部分抵消miRNA-24高表達對細胞增殖的抑制作用；這一效應在Sp1和eNOS表達的調節也有類似情況。造成這一效應的原因至少有以下3個方面：第一，血管內皮細胞的增殖是多因素調節的過程，而不是單一分子或基因所調控；第二，miRNA-24對eNOS表達的調控可能存在2種機制，一種是miRNA-24在轉錄階段直接抑制eNOS的表達，另外一種則通過調控eNOS基因的反式作用因子Sp1間接調控其表達。此外，Sp1和miRNA-24在對eNOS表達調控過程中所顯示出相反作用，進一步提示，Sp1與miRNA-24可能作為一種協同機制維持eNOS在機體的正常表達；第三, 由于Sp1是eNOS的正性轉錄調節因子之一，而我們的結果顯示miRNA-24抑制組的eNOS表達高于miRNA-24組，我們認為miRNA-24抑制物對eNOS的抑制程度高于Sp1，考慮到eNOS是內皮細胞的組織特異性蛋白，相對內皮細胞增殖的調控而言，這一結論更為合理。然而miRNA-24對Sp1的調控是否依賴其它因素，兩者是否有劑量依賴關系，尤其是這種關聯是否在其它的組織細胞中存在普遍性？這些問題有待進一步研究。

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