ApoE4對大鼠在體海馬L-LTP的影響及其分子機制的分析

喬 楓,祁金順

(山西醫科大學 基礎醫學院生理學系,細胞生理學教育部重點實驗室,太原 030001)

ApoE4對大鼠在體海馬L-LTP的影響及其分子機制的分析

喬 楓,祁金順

(山西醫科大學 基礎醫學院生理學系,細胞生理學教育部重點實驗室,太原 030001)

探討載脂蛋白E4(apolipoprotein E,apoE4)的神經毒性作用。將12只健康雄性SD大鼠隨機分成對照組和實驗組兩組(n=6)。采用電生理手段,利用海馬給藥裝置和刺激/記錄綁定電極記錄大鼠在體海馬CA1區場興奮性突觸后電位(fEPSP)和高頻刺激(HFSs)誘導的晚期長時程增強(L-LTP),觀察急性注射apoE4后對大鼠海馬CA1區L-LTP的誘導及維持的影響。并且通過Western Blotting檢測cAMP應答元件結合蛋白(CREB)的表達及其磷酸化水平,探討apoE4影響L-LTP的分子機制。結果表明,HFSs前注射0.2 μg apoE4并沒有改變突觸傳遞,對雙脈沖易化(PPF)沒有影響。但顯著抑制L-LTP的誘導和維持,降低CREB的磷酸化水平。說明apoE4可以損傷海馬L-LTP。這種神經毒性不是突觸前神經遞質釋放所介導,而是通過降低突觸后CREB活性實現的。

載脂蛋白E4;阿爾茨海默病;晚期長時程增強;cAMP應答元件結合蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種發生在中樞神經系統中的慢性、原發性、不可逆性的神經退行性疾病,主要表現為進行性認知功能障礙、學習和記憶能力喪失,晚期出現嚴重癡呆[1]。大量流行病學調查結果顯示有四種基因與其發生有關, 包括:淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)、早老素-1(presenilin-1, PS-1)、早老素-2(presenilin-2, PS-2)和載脂蛋白E4(apolipoprotein-E4, APOE4)。其中,APOE4是遲發家族AD的主要危險因子。APOE4基因純合子(apoE4+/+)攜帶者的AD發病率為未攜帶該基因者的8倍[2]!該基因過表達后的產物apoE4也被證明具有較強的神經毒性。目前已有資料表明,apoE4可與多種致病因素協同作用并且加速AD的發生[3]。長時程增強(long-term potentiation,LTP)是學習和記憶機制的細胞模型之一。鑒于海馬是AD發病過程中最早和最易受累的腦區之一,海馬LTP已被廣泛用于AD發病機制研究。LTP分為早期 LTP (early-phase LTP,E-LTP)和晚期LTP (late-phase LTP,L-LTP)。前者與膜上已有受體蛋白的磷酸化有關,后者則包括了新的蛋白質的合成。雖然apoE4和AD之間的關系已經被證實[4], 一些相關的電生理實驗就apoE4對E-LTP的作用做了一定的研究[5],但是apoE4對海馬L-LTP的影響及其分子機制,目前仍然不清楚。本實驗對apoE4的電生理機制及其分子機制進行了探究。

1 材料和方法

1.1 藥品與動物實驗分組

apoE4(購自sigma公司)經生理鹽水稀釋成0.1 μg/μL。CREB工作濃度(體積比)1∶7000，p-CREB工作濃度(體積比)1∶250，購自Abcam公司。二抗(工作濃度1∶100 000)購自中杉金橋公司。

健康雄性SD大鼠12只,體重為250～350 g,由山西醫科大學動物中心提供。實驗分為對照組 (n=6)和實驗組(n=6)。對照組給與2 μL生理鹽水。注藥組給與2 μL apoE4(質量濃度為0.1 μg/μL)。

1.2 手術及電極定位

所有動物均用25%烏拉坦腹腔麻醉(1.5 g/kg)。在三維腦立體定位儀上將大鼠固定后,暴露顱骨,以前囟點、矢狀縫為基準,用骨鉆于刺激/記錄電極和注藥位點鉆孔。刺激電極位點P:-4.2 mm,R:3.8 mm;記錄電極位點P:-3.8 mm,R:2.9 mm;注藥管位于P:-2.8 mm,R:2.0 mm。在立體定位儀和微推進裝置引導下,將刺激電極、記錄電極及不銹鋼給藥導管垂直插入大鼠海馬部位。刺激電極尖端位于Schaffer collateral/commissural pathway;記錄電極尖端位于CA1區放射層;給藥管尖端位于CA1區放射層,深度比記錄電極淺0.1 mm。

1.3 給藥及電生理記錄

用電刺激誘發海馬CA1區場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)。測試刺激的頻率為0.033 Hz,刺激強度以引起興奮性突觸后電位(fEPSP)最大幅度的50 %強度為準。記錄30 min基礎fEPSP以確保基礎性突觸傳遞的穩定性,用微量注射泵 (KD Scientific, Inc, KDS310, plus, USA)和5 μL微量注射器經導管以0.1 μL/min的速度將藥物或生理鹽水2 μL注入海馬。給藥后,繼續記錄30min的基礎fEPSP,以觀察藥物對基礎性突觸傳遞的影響。再給予雙脈沖刺激3 次,以誘發突觸傳遞的易化現象,即雙脈沖易化(paired-pulse facilitation, PPF),用以分析藥物是否影響突觸前神經遞質的釋放。誘發PPF的雙脈沖刺激間隔是50 ms。之后,給予高頻刺激(HFSs)。HFSs共有三組,組間隔5min,每組共3個串刺激,串間隔30 s,每串刺激包含20個脈沖,頻率200 Hz,波寬50 μs。HFSs后,連續記錄3 h fEPSP以觀察L-LTP的持續性變化。

所有數據經多道生物信號處理系統(RM6240B/C)進行信號采集、 放大和儲存。離線分析時,以其基礎 fEPSP的幅度值作為100%,計算HFSs前后各時間點fEPSP幅度改變的百分比。HFSs后以fEPSP幅度值增加超過30%為L-LTP的成功誘導。最后以fEPSP幅度變化百分比作為縱坐標,時間為橫坐標,繪制L-LTP隨時間變化情況。

1.4 Western免疫印跡

電生理記錄后,取大鼠海馬,提取蛋白,用BCA法檢測蛋白濃度。各孔加上樣蛋白25 μg,進行SDS-PAGE電泳。之后,將蛋白轉到PVDF膜上,5%的BSA封閉,4℃一抗孵育過夜,TBST洗膜3×10 min。4℃二抗孵育2 h,洗膜。用ECL發光液顯色,由FluorChem Scanner采集,Alpha View SA software分析。以對照組的灰度值作為100%,計算注藥組CREB的總蛋白量及其磷酸化水平改變的百分比。

1.5 統計學處理

所有的數據以x±s表示。運用SPSS 14.0統計軟件進行兩樣本均數比較的t檢驗,以P<0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 急性注射apoE4抑制 L-LTP的誘導及維持

對照組中,在基礎的fEPSP幅度保持穩定的基礎上,給予HFSs能夠有效誘導L-LTP的出現，如圖1-a所示。HFSs后1，60，120 ，180 min的平均fEPSP幅度分別是(211±7.2)%，(170.4±4.5)%，(164.2±2.9)%，(161.2 ±3.3)%。如圖1-b所示。與對照組相比,HFSs前30 min注射0.2μg apoE4并沒有改變突觸傳遞。給予HFSs后,在相同的時間點,apoE4顯著抑制L-LTP的誘導和維持,平均fEPSP幅度分別是(178.3±5.8)%，(149.7±5)%，(144.3±5.0)%，(142.2±5)%(P<0.01)。

2.2 注射apoE4對雙脈沖易化(PPF)無影響

為了闡明突觸前神經遞質的釋放是否參與了apoE4對海馬CA1區L-LTP的抑制。在注射生理鹽水或apoE4(0.2 μg)后,觀察了各組雙脈沖易化(見圖2)。PPF比值分別為(164.8±3.4)%和(163.2±3)%(P>0.05)。未受影響的PPF表明apoE4的L-LTP誘導的抑制作用可能不是通過突觸前神經遞質的釋放介導的,而是作用在突觸后的信號通路。

圖2 apoE4不影響PPF

2.3急性注射apoE4抑制了CREB的磷酸化水平,對其總蛋白含量沒有影響

Western免疫印跡結果顯示,實驗組中p-CREB的表達水平下降,是對照組的(64.80±12.58)%(P<0.05),有統計學意義。而CREB的總蛋白量是對照組的(95.24±11.45)%(P>0.05),沒有統計學意義(見圖3)。

圖3 apoE4抑制了CaMKII和CREB的磷酸化,對其總蛋白含量沒有影響

3 討論

apoE4是遲發家族AD的主要危險因子。而apoE4對LTP的作用存在著很大的爭議。有研究表明用apoE4轉基因鼠的離體腦片可以抑制LTP的誘導[3, 6],但是有些實驗室卻發現apoE4可以促進LTP的誘導與維持[4]。由于這些實驗多為離體實驗,不能很好的反映體內正常生理環境。本實驗采用在體LTP記錄的方法,在記錄海馬 CA1區fEPSP的基礎上,將apoE4直接注射到海馬CA1區,觀察了局部給予apoE4對海馬突觸傳遞的直接效應。我們發現,急性注射apoE4不影響基礎性fEPSP,但L-LTP的誘導與維持明顯低于對照組,且差異具有統計學意義。與此同時,PPF未受影響。這表明,apoE4的神經毒性作用主要是對L-LTP誘導和維持有抑制作用。此作用不是通過突觸前神經遞質的釋放介導的,而是作用在突觸后的信號通路。

L-LTP形成機制的研究主要集中在N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體依賴的細胞內級聯反應上[7]。強直刺激作用下,突觸后膜發生去極化,膜上的NMDA 受體通道上的Mg2+離開,解除對其的阻塞,使得NMDA受體與興奮性神經遞質谷氨酸結合并開放,進而出現Ca2+內流、 胞內Ca2+濃度升高[8],從而使CaMKⅡ、cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)等活性增加[9-10],引起下游一系列生化反應,最終使CREB磷酸化。活化的CREB促進轉錄翻譯,產生新的蛋白質[11-12]。apoE4可以與apoE受體2(apoE receptor2,apoER2)結合。apoER2會通過NPxY 模、Dab1以及SFKs作用于NMDA受體[13-15]。進而對LTP產生作用。本實驗發現apoE4對CaMKII及CREB的總蛋白量沒有影響,但對其磷酸化水平有抑制作用。說明apoE4對L-LTP的毒性作用很有可能是通過抑制了CREB和磷酸化來抑制了L-LTP的誘導與維持。

4 結論

動物實驗研究了apoE4的神經毒性作用及其靶點,結果表明apoE4可以損傷海馬L-LTP。這種作用不是突觸前神經遞質釋放所介導,而是通過降低突觸后CREB活性實現的。因此,實驗為apoE4的神經毒性作用和機制提供了重要線索,從而為預防和治療AD提供新的實驗證據。

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(編輯：張愛絨)

EffectsofApolipoproteinE4onHippocampalLate-phaseLong-TermPotertiationofRatsinvivoandAnalysisofMolecularMechanism

QIAOFeng,QIJinshun

(DepartmentofPhysiology,KeyLaboratoryofCellularPhysiology,MinistryofEducation,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)

To investigate the neurotoxicity of apolipoprotein E4 (apoE4) and the underlying mechanisms, we recorded in vivo late-phase long-term potentiation (L-LTP) of field excitatory postsynaptic potentials (fEPSPs) in hippocampal CA1 region of rats. Twelve male SD rats were used and the L-LTP was induced by three groups of high frequency stimulations (HFSs). ApoE4 solution (0.1μg/μL, 2 μL,n=6) was injected into the CA1 region of hippocampus 30 min before HFS. Control rats (n=6)

only saline (2 μL,n=6). The paired pulse facilitation (PPF) was also recorded. The expression and phosphorylation levels of cAMP response element-binding protein (CREB) were measured by Western Blotting. The results show that apoE4 did not change the base line synaptic transmission and the PPF, but significantly impair the induction and the maintenance of L-LTP. In addition, the apoE4 decreasd the phosphorylation levels of the CREB in the hippocampus. These results strongly suggest that the neurotoxicity of ApoE4 on the synaptic plasticity was mainly involved in the suppression of L-LTP. And the attenuation of L-LTP was not mediated by presynaptic neurotransmitter release, but by the postsynaptic signaling. The decrease of the CREB phosphorylation in the hippocampus seemed to be related to the neurotoxicity.

apolipoprotein E4 (apoE4); Alzheimer’s disease (AD); late-phase long-term potentiation (L-LTP); cAMP response element-binding protein (CREB)

2013-11-19

國家自然科學基金資助項目(31271201);山西省自然科學基金資助項目(2009011054-2)

喬楓(1987-),女,山西大同人,碩士生,主要從事神經生理學研究,(E-mail)qiaofeng-fq@163.com，13753189173

祁金順,男,教授,(E-mail)jinshunqi2006@yahoo.com

1007-9432(2014)02-0244-04

R743

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