復合性狀轉基因水稻B2A68在南京地區雜草化的風險評估

黃 鷂，王 建，戴偉民，強 勝，肖國櫻，宋小玲

(1.南京農業大學雜草研究室，江蘇南京 210095；2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，湖南長沙 410125)

復合性狀轉基因作物指同一植株中含有2個或2個以上的轉基因性狀或轉化體的作物[1]。復合性狀轉基因作物具有明顯的優勢，在擁有更廣闊的農藝性狀以適應非適宜環境的同時，還可以提高產量[2-3]。在所有復合性狀中，抗除草劑性狀與抗蟲性狀是主要的復合性狀，成為將來轉基因作物發展的一個重要方向。

植物雜草化(weediness)是指原本自然分布的栽培植物，在新的人工生境中能自然繁殖其種群而轉變為雜草的演化過程。轉基因作物由于插入抗蟲、抗病、抗除草劑等基因，具有了更強的適應性，在生長勢、越冬性、種子產量和種子越冬能力等方面可能比非轉基因植株強，入侵性提高，從而占據其他植物的棲息地，影響生物多樣性，破壞自然種群平衡。盡管從目前的研究來看，單一性狀的轉基因水稻在生存競爭能力、自生苗以及越冬能力等方面與非轉基因受體以及當地常規水稻相比無明顯區別，且雜草化的風險較小[4]。但由于復合性狀的轉基因作物轉入了2個外源基因，外源基因引起的轉基因作物生存競爭能力的改變可能比單一性狀的轉基因更為復雜。

現有的報道都是針對單一性狀轉基因作物的生存競爭能力，如宋小玲等對孟山都公司的轉基因大豆進行了雜草化研究，發現抗草甘膦轉基因大豆在江蘇省南京地區演化為雜草的可能性較小[5]；崔榮榮等對抗草銨膦轉基因水稻明恢86B進行了雜草化評估，發現明恢86B演化為雜草的可能性不大[4]；陳小文等比較了轉Cyr1Ac基因的抗蟲玉米及其受體在荒地中的生存競爭情況，發現該轉基因玉米品種演化為超級雜草的可能性很小[6]；張興華等對轉雙價抗蟲棉進行了生存能力競爭研究，發現抗蟲棉的生存競爭能力強于其非轉基因受體[7]。但鮮有復合性狀轉基因作物的相關報道。

本研究以轉Cry2Aa#和轉Bar基因的抗蟲抗除草劑轉基因水稻B2A68為供試材料[8]，探索復合性狀轉基因水稻的雜草化潛力，以期為該復合性狀轉基因水稻的安全性評估提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

轉基因水稻B2A68：由湖南雜交水稻研究中心提供，該水稻攜帶單拷貝的抗蟲基因Cry2Aa#與抗除草劑草銨膦的Bar基因，受體水稻為早稻D68。

轉基因水稻Bar68-1：轉入抗除草劑草銨膦Bar基因，其親本受體同上，由香港中文大學、湖南雜交水稻研究中心與中國科學院亞熱帶農業生態研究所合作培育。

當地常規稻：寧粳46，粳型。

1.2 方法

1.2.1 試驗基地概況 試驗在南京農業大學雜草研究室轉基因水稻安全性評估試驗基地進行。土壤pH值大于6小于7，偏酸性，肥力良好、排灌情況良好。試驗地栽培管理按當地常規栽培方式播種后，不加以其他管理措施。試驗期間無影響整個試驗結果的惡劣氣候因素，試驗地設專人看管，設圍攔以防止人為或動物破壞。需要收獲的轉基因水稻材料單獨收獲、單脫、單藏，由專業技術人員專人運輸和保管。檢測試驗完畢后，除需要保留的材料外，剩余的轉基因試驗材料一律燒毀。試驗地四周有 2 m 高的圍欄，100 m范圍內無水稻種植，符合國家相關規定。

1.2.2 轉基因水稻生存競爭力試驗

1.2.2.1 試驗設計 處理1：直播。采用3種種植密度即高密度(300粒/m2)、中密度(150粒/m2)、低密度(75粒/m2)，小區面積為4 m2(2 m×2 m)。分4期播種，適宜期2期，分別為2012年6月19日(Ⅰ)和2012年6月29日(Ⅱ)；非適宜期2期，分別為2012年7月9日(Ⅲ)和2012年7月20日(Ⅳ)。每處理4次重復，采用隨機區組排列。

處理2：移栽。用25～30 d秧苗單株移栽，株距20 cm，行距20 cm。小區面積6.8 m2(2 m×3.4 m)，各處理隨機排列。

1.2.2.2 調查內容 雜草調查：采用對角線5點取樣法，直播方式播種的樣方面積為0.1 m2，移栽方式的樣方面積為1 m2。在播種后30、60 d調查記錄每小區雜草種類、株數，按雜草垂直投影面積占小區面積的比例估算出雜草的相對覆蓋率。

競爭力調查：直播方式在播種后10 d、移栽方式在水稻移栽后15 d調查記錄每小區的水稻株數及成苗率，以后每隔15 d每小區隨機調查10株長勢最好的水稻，測量其主莖株高、分蘗數。

1.2.3 轉基因水稻繁殖能力

1.2.3.1 試驗設計 本試驗的田間試驗設計同“1.2.2”部分，在生存競爭力試驗田中進行。

1.2.3.2 調查內容 花粉活力檢測：每小區隨機取10株水稻，每株水稻取3朵小花。采用常規I2-KI染色法進行檢測。

生殖生長指標統計：水稻成熟后每小區采收10株長勢最好的水稻，統計每株主穗的穗長、每穗飽粒數、每穗總粒數、落粒數、地上部生物量，并計算出結實率(結實率=每穗飽粒數/每穗總粒數×100%)和落粒率，落粒率的檢測及計算參照崔榮榮等的方法[4]，落粒率水平參照應存山的方法[9]。

1.2.4 自生苗和再生苗 在生存競爭力試驗的同一塊田中進行。除繁殖力考察中每小區采收10株水稻外，其余水稻均不收割，讓其自然落在土壤中，田塊冬季閑置，不進行任何管理。在收完需考察的水稻后，每隔20 d調查一次試驗小區內的自生苗和再生苗情況，共調查2次，并在翌年當地水稻分蘗期后調查一次自生苗和再生苗。通過考察轉基因水稻作物演化成自生苗的比例，評價轉基因水稻的自然延續能力。對出現的自生苗取樣后帶回實驗室驗證，調查結束后翻耕。

1.2.5 種子生存能力

1.2.5.1 種子萌發試驗 水稻種子收回后30 d按GB/T 3543.4—1995《農作物種子檢驗規程 發芽試驗》規定的方法檢測發芽率。

1.2.5.2 種子埋藏試驗 種子埋藏試驗于2013年1月20日進行，按隨機區組試驗設計，設淺埋(3 cm)和深埋(20 cm)2種埋藏深度。取待測種子25粒裝于200目的尼龍網袋中，4次重復，埋藏地點在水稻生存競爭力試驗田，并分別于埋后2、4、6個月取出種子進行種子萌發試驗，并統計已腐爛數。不能萌發的種子用TTC法檢測種子是否有活力。

2 結果與分析

2.1 雜草調查結果

直播稻田播后30 d時第Ⅰ期和第Ⅱ期雜草發生量很大，主要是異型莎草(CyperusdifformisLinn.)、稗草[Echinochloacrusgalli(L.) Beauv.]、水莧菜(AmmanniabacciferaLinn.)，占雜草發生量的65%，其次還有少量的鴨舌草[Monochoriavaginalis(Burm. f.)C. Presl]、四葉萍[MarsileaquadrifoliaL.(E)pepper Wort]、水虱草[Fimbristylismiliaceae(L.)Vahl.]、節節菜[Rotalaindica(Willd.) Koehne]。同一水稻品種，高密度播種方式下的雜草量略低于低密度下的雜草量，但總體上來說，B2A68、Bar68-1和常規稻的小區雜草數量沒有顯著差異。第Ⅰ期、第Ⅱ期總草覆蓋率在45%～65%。播后 60 d 時，千金子大量發生，占總草的50%以上，千金子與水稻的高度比約為1.6 ∶1，總草覆蓋率達到80%。

直播第Ⅲ期和第Ⅳ期，各小區雜草發生量差異不顯著，播后30 d雜草發生量較第Ⅰ期和第Ⅱ期少，主要雜草為千金子和異型莎草，占總草的44%左右，其次還有少量的水虱草、節節菜等，總草覆蓋率為56%～60%。播后60 d時，千金子成為主要的雜草，占總草的60%以上，總草覆蓋率約為70%。

移栽水稻田移栽后30 d雜草與直播水稻相比發生量不大，主要雜草為異型莎草，覆蓋率約為20%，下層有少量的空心蓮子草[Alternantheraphiloxeroides(Mart.) Griseb.]和節節菜。

2.2 轉基因水稻生存競爭力

2.2.1 出苗率 由表1可知，在第Ⅰ期，相同水稻在不同密度下的出苗率無顯著差異，相同密度下不同水稻的出苗率也無顯著差異。

在第Ⅱ期，B2A68低密度種植出苗率顯著低于中密度，但與高密度處理下的出苗率無顯著差異；Bar68-1在不同密度處理下的出苗率均沒有顯著差異；而常規稻3種種植密度之間的出苗率存在很大差異，其中中密度的出苗率顯著高于高密度、低密度。在相同密度處理下，中密度時3種水稻的出苗率無顯著差異，高密度、低密度時常規稻的出苗率顯著低于2種轉基因水稻。

第Ⅲ期和第Ⅳ期的情況與第Ⅰ期相同，即相同水稻在不同密度下的出苗率無顯著差異，相同密度下不同水稻的出苗率也無顯著差異。種植密度和播種時間對同一水稻品種的出苗率影響不大。

從出苗率的整體情況考察，B2A68沒有表現出比Bar68-1更高的出苗率，2種轉基因水稻的出苗率相當，多在70%以上；與常規稻相比，供試的2種轉基因水稻在大多數情況下沒有表現出更高的出苗率，但在第Ⅱ期高密度、低密度時2種轉基因水稻的出苗率顯著高于常規水稻的出苗率。

2.2.2 株高 直播第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的株高見圖1。25～70 d的株高調查結果顯示，同一密度處理下B2A68和Bar68-1多高于常規稻，且2種轉基因水稻之間的株高差異不顯著。但是從4期的最終株高來看，3種水稻的株高差異不明顯。研究結果還表明，相同水稻在不同種植密度下的株高沒有顯著差異，說明種植密度對株高影響不大。從數值上相比，第Ⅳ期的3種水稻的最終株高均低于前3期的相同品種的水稻，而前3期水稻的最終株高沒有顯著差異。

在移栽條件下，移栽后25～40 d，B2A68和Bar68-1的株高顯著高于常規稻，但2種轉基因水稻間的株高差異不顯著；55 d至最終，常規稻株高顯著高于2種轉基因水稻(圖2)，說明在草壓較小的情況下，2種轉基因水稻的長勢比常規稻弱。

表1 直播方式種植的3種水稻播種后10 d的出苗率(平均數±標準誤)

2.2.3 分蘗 由圖3可見，第Ⅰ、Ⅱ期，在播后 25～55 d，由于雜草競爭條件的存在，3種水稻的分蘗數都呈現出先增后減的趨勢。相同水稻在不同密度處理下分蘗數差異不大，相同密度處理下不同水稻的分蘗數差異也不大。第Ⅲ、第Ⅳ期由于處在水稻生長發育的非適宜期，各種水稻的分蘗數都很少。第Ⅳ期不同處理下的3種水稻分蘗數均為0。

在移栽條件下，3種水稻的分蘗數沒有顯著差別(圖3)。移栽后70 d調查的結果顯示，3種水稻的分蘗數量均在9～11個之間。

從分蘗數量上分析，在直播適宜期和非適宜期，在相同密度處理以及移栽條件下，3種水稻的分蘗數沒有顯著差異。

2.3 繁殖力調查

2.3.1 花粉活力 通過觀察和統計，3種水稻花粉活力在97%～99%之間，無顯著差異，花粉活力相當。

2.3.2 生育期比較 通過觀察和統計，3種水稻在4個播期下都能夠完成生活史，B2A68和Bar68-1的花期基本一致，常規稻的花期比2種抗性水稻晚：第Ⅰ、Ⅱ期晚10～14 d，第Ⅲ、Ⅳ期晚6～10 d(表2)。

2.3.3 生殖指標分析 由表3可知，從整體來看，相同水稻在不同密度下的生殖指標沒有太大差異。而在相同密度處理下，直播適宜期和非適宜期的2種轉基因水稻所考量的穗長和每穗飽粒數多顯著高于常規稻，2種轉基因水稻之間差異不顯著；2種轉基因水稻與常規水稻相比，結實率和地上部生物量無顯著差異。從數值上看，適宜期的各項指標(除結實率)整體上比非適宜的要高，說明B2A68和Bar68-1在不良氣候條件下生長競爭能力變弱。與當地常規稻相比，在直播條件下，無論是適宜期還是非適宜期，2種轉基因水稻的生殖指標(除結實率)都要高于常規水稻。就生殖生長指標分析，2種轉基因水稻沒有顯著差異，說明轉基因水稻沒有因為導入了2種外源基因而生長競爭力就變強。

表2 B2A68、Bar68-1、常規稻在4種播期下的花期(2012)

由表4可知，常規水稻的穗長顯著小于2種轉基因水稻，但每穗飽粒數顯著大于2種轉基因水稻，2種轉基因水稻之間無顯著差異；常規水稻和轉基因水稻的結實率和地上部生物量無顯著差異。這說明在生殖能力方面2種轉基因水稻弱于常規水稻。

表3 供試水稻在直播條件下的生殖指標

表4 供試水稻在移栽條件下生殖指標

2.3.4 落粒性 B2A68的落粒率為13.33%，Bar68-1的落粒率為12.80%，常規稻的落粒率為7.02%。在外力條件下，2種轉基因水稻的落粒率顯著高于常規稻。但參照應存山的報道[9]，3種水稻的落粒性都處于中等水平。

2.3.5 自生苗情況 在收回需要考種的水稻之后對田間的自生苗進行調查，調查發現各小區中均無自生苗出現。

2.3.6 種子生存能力

2.3.6.1 種子萌發率 水稻種子收獲后30 d，從其萌發情況(圖4、圖5)來看，不論在直播還是移栽條件下，2種轉基因水稻的萌發情況一致，7 d時的萌發率均在80%以上。不同處理下的常規稻3 d時萌發率有所差異，但是7 d時萌發率接近100%。2種轉基因水稻的萌發相對不齊，全部萌發所需時間更長，到11 d時仍有少數種子不能萌發。常規稻沒有休眠的種子，而2種轉基因水稻未能萌發的種子用TTC檢測后發現只有不到0.01%的種子保持活力，處于休眠狀態。

2.3.6.1 種子活力保存能力 埋藏前，3種水稻種子活力均在90%以上，但是經過埋藏后，不論是淺埋還是深埋，3種水稻種子活力都有一定程度的下降。其中經過2個月淺埋后的B2A68和Bar68-1的種子活力迅速降低到20%左右，深埋處理下2種轉基因水稻種子活力迅速降低到13%左右；而常規稻在淺埋和深埋處理下2個月種子活力沒有迅速降低，均保持在80%以上。4～6個月，3種水稻種子活力下降得相對緩慢。2～6個月的淺埋和深埋處理下，2種轉基因水稻的種子活力無顯著差異，但顯著低于常規稻，說明2種轉基因水稻種子在土壤中保持活力的能力弱于常規稻(圖6、圖7)。

3 結論與討論

雜草是能夠在人工生境中自然繁衍其種族的植物，最大特點是適應性、持續性、危害性[10]。當一個或多個外源基因導入水稻后有可能提高水稻的生存競爭能力，而競爭力是判斷植物是否具有雜草性的主要因子之一。植物的競爭力強弱受到一系列影響因子的影響，如種子萌發特性、株高、生物量等[11]。本試驗中供試的復合性狀轉基因水稻B2A68在出苗率上與單一性狀轉基因水稻Bar-68是一致的，并沒有表現出更高的出苗率。而在有相似雜草競爭的環境下，B2A68與Bar-68在株高、分蘗、花粉活力、穗長、主穗飽粒數、結實率、落粒性、土壤中種子活力保存能力等方面都沒有顯著差異，說明B2A68并沒有因為導入2種外源基因而與單抗水稻Bar-68產生顯著不同，沒有表現出更強的競爭能力，演化為雜草的可能性也沒有因此變大。2種轉基因水稻與當地種植的常規稻寧粳46相比，在相似的草壓下都沒有更強的侵略性。本試驗結果表明，以早秈稻D68為受體的轉入抗蟲抗除草劑的復合性狀轉基因抗水稻B2A68與單一性狀轉基因水稻Bar-68在整個生活史中競爭能力相似，沒有明顯的雜草化傾向，而且與當地常規稻相比，復合性狀轉基因水稻B2A68生存競爭優勢也不突出，該水稻在南京地區演化為雜草的可能性不大。

休眠性和落粒性是評價作物雜草化潛力較為重要的2個特點，休眠性可以讓雜草避開非適宜期，這一特征與植物成為入侵能力強的雜草密切相關[12]。由于外源基因插入到水稻基因組的位置是隨機的，所以造成的影響是復雜和未知的。水稻休眠是由多個數量性狀位點(QTL)所控制，這樣的位點在水稻染色體上都有分布，在第12條上分布得最為廣泛[13-16]。外源基因的插入有可能造成水稻休眠性增強或降低，但是目前尚沒有這類報道，本試驗中的轉基因水稻沒有因為插入外源基因而使水稻休眠性發生明顯的變化。落粒性是雜草的一種繁衍種族的機制，也是作物與雜草最大的區別之一。在水稻中迄今已定位5個落粒基因(sh-1、sh-2、sh-3、sh-4 和sh-h)，與落粒相關的主效QTL也研究得很多[17]。在評價轉基因作物的雜草化中，落粒性是一項重要的指標，本研究中2種外源基因與1種外源基因導入水稻后對水稻落粒性的影響并沒有顯著差異，說明本試驗水稻外源抗蟲抗除草劑基因并沒有觸發水稻的落粒性。

目前復合性狀應用較多的植物是玉米和棉花，但是水稻是世界上主要的糧食作物之一，針對復合性狀的轉基因水稻的雜草化環境風險制定一份標準是十分必要的。雖然復合性狀業已成為發展最快的基因技術之一，但是種植了復合性狀轉基因作物的國家和地區對其監管的要求、內容卻各不一樣。如美國、加拿大、巴西依據單個轉化事件管理復合性狀轉基因作物。歐盟對復合性狀轉基因作物的管理較為嚴格，評價時主要考慮插入基因的完整性和表型的穩定性及復合性狀轉基因之間可能的相互作用，從選擇合適的參照物、成分的比較分析、毒性、過敏性和營養價值評價以及環境評價等方面評價其相互作用帶來的影響[1，18-20]。但我國尚未出臺復合性狀轉基因作物雜草化環境風險的評價標準。在轉基因技術快速發展的今天，需要加強對復合性狀轉基因作物的研究和管理。本試驗的開展可以為復合性狀轉基因水稻安全性評估標準的制訂提供一定的試驗依據。本試驗比較的是復合性狀和單一性狀轉基因水稻的雜草化風險，但是為了完整地制定管理標準，還需在試驗中設置非轉基因受體水稻空白對照進行研究。

參考文獻：

[1]劉培磊，李 寧，程金根. 不同國家和地區復合性狀轉基因作物安全評價管理的比較[J]. 農業科技管理，2008，27(3)：23-26.

[2]Halpin C. Gene stacking in transgenic plants-the challenge for 21st century plant biotechnology[J]. Plant Biotechnology Journal，2005，3(2)：141-155.

[3]ISAAA. Pocket K No. 42：Stacked traits in biotech crops[EB/OL]. [2014-02-03]. http：//www.isaaa.org/resources/publications/pocketk/42/.

[4]崔榮榮，韋 穎，孟攀潘，等. 抗草銨膦轉基因水稻明恢86B雜草化潛力評價[J]. 中國水稻科學，2012，26(4)：467-475.

[5]宋小玲，強 勝，彭于發. 抗草甘膦轉基因大豆[Glycinemac(L.) Merri]雜草性評價的實驗實例[J]. 中國農業科學，2009，42(1)：145-153.

[6]陳小文，李吉崇，郭玉海，等. 抗蟲轉基因玉米荒地生存競爭力評價[J]. 雜草科學，2012，30(1)：31-34.

[7]張興華，田紹仁，張天玉，等. 轉雙價雙Bt基因(Cry1Ac+Cry2Ab)抗蟲棉栽培地生存競爭能力研究[J]. 現代農業科技，2012(3)：78-79，84.

[8]翁綠水，蔣利平，肖國櫻. 抗蟲抗除草劑轉基因水稻恢復系B2A68的培育[J]. 雜交水稻，2013，28(1)：63-67.

[9]應存山. 中國稻種資源[M]. 北京：中國農業科學技術出版社，1993：164-185，530-533.

[10]強 勝. 雜草學[M]. 北京：中國農業出版社，2001：1-2.

[11]杜 峰，梁宗鎖，胡莉娟. 植物競爭研究綜述[J]. 生態學雜志，2004，23(4)：157-163.

[12]李 博. 植物競爭：作物與雜草相互作用的實驗研究[M]. 北京：高等教育出版社，2001：3-4.

[13]盧丙越. 水稻品種N22強休眠性的QTL定位及遺傳解析[D]. 南京：南京農業大學，2011.

[14]江 玲，張文偉，翟虎渠，等. 水稻種子休眠性基因座的定位和分析[J]. 中國農業科學，2005，38(4)：650-656.

[15]Ye H，Foleyb M E，Gua X You. New seed dormancy loci detected from weedy rice-derived advanced populations with major QTL alleles removed from the background[J]. Plant Science，2010，179(6)：612-619.

[16]Guo L B，Zhu L H，Xu Y B，et al. QTL analysis of seed dormancy in rice (OryzasativaL.)[J]. Euphytica，2004，140：155-162.

[17]楊紹華，楊 玲，李建君，等. 水稻落粒性的研究進展[J]. 天津農業科學，2011，17(3)：112-114.

[18]Davies H，Sweet J. Risk assessment of plants containing genetic modification events combined by crossing[EB/OL]. (2006-06-08)[2013-12-10]. http：//www.efsa.europa.eu.

[19]Datta K，Baisakh N，Thet K M，et al. Pyramiding transgenes for multiple resistance in rice against bacterial blight，yellow stem borer and sheath blight[J]. Theor Appl Genet，2002，106(1)：1-8.

[20]EFSA. Guidance document of the scientific panel on genetically modified organisms for the risk assessment of genetically modified plants containing stacked transformation events[EB/OL]. (2007-05-16)[2013-12-10]. http://www.efsa.europa.eu.