轉錄因子Hand2在妊娠期糖尿病胎鼠心臟發育過程中的表達

吳 瑕， 黃婉儀， 韓莎莎， 孫鳳杰， 徐 婧， 楊雪松， 柳國勝△

(暨南大學 1附屬第一醫院新生兒科， 2醫學院組織學與胚胎學系，廣東 廣州 510632)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)的發病率在迅速增加，全球GDM的發病率在3%～14%之間[1]。澳洲開展流行病學調查顯示亞裔婦女的發病率最高(11.5%)，是澳洲婦女發病率的3倍(3.7%)[2]。2006年中國18城市的調查表明，GDM的總體發病率為4.3%。GDM可致胎兒發育異常，尤其是胎兒心臟畸形發生率高且嚴重影響患兒的生存質量。美國研究顯示GDM孕婦其胎兒患心血管畸形(尤其是流出道畸形以及心臟瓣膜發育異常)的幾率是正常妊娠的3～5倍[3]。

堿性螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)蛋白是與各種類型的細胞核組織的發育和功能相關的轉錄因子。Hand1和Hand2是bHLH蛋白家族中最重要的轉錄因子，尤其對心肌細胞的增殖和分化、心臟發育模式及形態發生和心臟收縮有著重要的調控作用，與先天性心臟病的發生關系密切[4]。學者通過鼠的基因敲除等手段發現，純合體(Hand2-/-)突變鼠可出現明顯的心肌缺陷，這些心肌缺陷主要表現為心管環化障礙、右心室缺失、主動脈弓消失等[5]。本研究旨在了解GDM 胎鼠心臟發育過程中Hand2表達的變化，為深入探討其在GDM胎鼠心臟發育異常中的作用機制奠定基礎。

材 料 和 方 法

1 動物和材料

無交配史的清潔級雌性成年SD大鼠120只，體重(260±18) g，雄鼠60只，體重(301±14) g。采購于廣東省醫學實驗動物中心，動物許可證號為SCXK(粵)2010-0002。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma; Trizol 提取液購自Invitrogen；Hand2 抗體購自Santa Cruz； SABC試劑盒及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司； 蛋白樣品初步定量采用南京凱基生物發展有限公司提供的試劑盒(型號為KGPBCA)；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

2 方法

2.1動物分組與模型制備[6]將無交配史的清潔級成年SD大鼠雌雄分開喂養，適應性喂養1周后，尾靜脈采血測定雌鼠空腹血糖，若血糖>7.1 mmol/L，予以剔除。本實驗未剔除任何雌鼠。然后按雌雄比例2∶1合籠，第2天早上取陰道分泌物涂片，見精子之日定為妊娠第0天(E0)。飼養過程中有6只雌鼠未受孕或意外死亡，共有114只雌鼠成功受孕，受孕后單獨飼養，隨機分配到以下4組。

空白對照組(blank control組，n=24)：不加任何干預，受孕后72 h尾靜脈采血測定血糖。

GDM組(n=30)：將查到精子的大鼠空腹8 h后，用現配的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.l mmol/L，pH 4.4)配制成2% STZ新鮮溶液，按40 mg/kg一次性單側腹腔(近胰腺部位)注射[7]，4 h后給予正常飲食，72 h后尾靜脈采血測定血糖。若母鼠血糖>8.12 mmol/L，可進入下一階段實驗流程；若血糖<8.12 mmol/L，則按10～15 mg/kg補注STZ，直至血糖>8.12 mmol/L。

檸檬酸組(negative control組，n=30)：將查到精子的大鼠空腹8 h后，用等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.l mol/L，pH 4.4，現配)，一次性單側腹腔(近胰腺部位)注射，4 h后正常飲食，72 h后尾靜脈采血測定血糖。

胰島素干預組(insulin組，n=30)：按上述GDM組處理后血糖>8.12 mmol/L者，每天下午5～6時皮下注射中效胰島素(諾和銳30R)16～20 U·kg-1·d-1，根據血糖水平每天調整胰島素用量,使空腹血糖控制在4.8～7.0 mmol/L，直至解剖取胎當天。

2.2標本收集與樣本制備 給藥72 h 后每天檢測孕鼠血糖及體重，各組分別于孕12 d(embryotic day, E12)、E15和E19隨機剖宮，觀察孕鼠流產情況，檢查胎鼠的外部形態 (包括活胎、死胎及吸收胎等) ，稱量胎鼠體重并取材。本實驗中胎鼠發育異常情況參考了毛東偉等[8]所做的定義：死胎是指子鼠發育成形后死于宮內；吸收胎是指子鼠尚未發育成形即逐漸被母體所吸收，尚留有部分組織，可出現液化或壞死的胚胎。

2.3HE染色 采用4%多聚甲醛溶液固定各實驗組心臟組織，常規脫水及石蠟包埋，制備成3μm連續切片后行HE染色，光鏡下觀察各組胎鼠心臟組織的病理學改變。

2.4胎鼠心臟組織Hand2 mRNA的檢測 采實時用熒光定量PCR法，以β-actin為內參照,檢測胎鼠心臟Hand2 mRNA表達。Trizol法提取胎鼠心臟組織總RNA，逆轉錄為cDNA，取2 μL進行PCR反應，體系為25 μL，Hand2正義鏈5’ -TCCTACAGTCCCGAGTACGCCA-3’，反義鏈5’- GGCACTTGAATGGTATTTGGAGA -3’;β-actin正義鏈5′- ACCACAGTCCATGCCATCAC -3′，反義鏈5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。反應條件為95 ℃預變性1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，共40個循環。以β-actin為內參照，利用2-ΔΔCT方法分析不同組間Hand2的表達水平。

2.5免疫組化檢測Hand2蛋白表達 常規石蠟包埋，制作6μm切片。采用免疫組織化學SABC法染色，DAB顯色，經蘇木素復染后，鹽酸乙醇分化；脫水、透明，中性樹膠封片、光鏡下檢查。染色均設立以PBS代替Ⅰ抗的陰性對照組。每個時點每組隨機抽取5張不同切片，每張切片于光鏡下(×200)隨機選取5個視野，固定窗口面積，利用Q-win圖像分析系統，測定平均灰度值以表示陽性產物的強度。

2.6Western blotting 檢測Hand2蛋白表達水平 取胎鼠心臟組織約100 mg，冰上操作，加500 μL RIPA裂解液于勻漿器中反復碾碎并離心以提取總蛋白；依據試劑盒說明書對蛋白樣品初步定量，取10 μL蛋白溶液加樣品處理液煮沸5 min，SDS-PAGE 120 min轉至PVDF膜后，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h；洗膜后加I抗，室溫孵育4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；加II抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min；將化學熒光發光底物均勻地加到膜的表面，且反應持續5 min；去除膜表面的殘液，置于曝光盒中曝光、顯影、定影；采用凝膠圖像處理系統分析條帶灰度值。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件處理，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間采用2檢驗和t檢驗，組內差異采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組胎鼠心臟組織病理學變化

正常大鼠胚胎在E12時，心臟外型上已基本具備成體心臟的雛形，心臟房間孔已發育基本完全。室間隔肌部與心內膜墊之間留有室間孔。E15時，室間孔消失，室間隔膜部形成，至此心室完全分隔為左右心室，同時心房壁上出現較少的短小肌小梁結構，心室壁增厚，心肌小梁增多。E19時，心臟繼續逐漸增大，心房心室壁繼續逐漸增厚，心肌小梁逐漸增多、增粗，同一孕期心臟大小均一，未見心肌壁異常增厚，房室間隔病理性缺損、動脈圓錐干畸形等異常情況。高倍鏡下可見心肌細胞呈橢圓形，胞漿豐富。核大，形態規則，染色均勻。可見心肌肥厚及室間隔缺損，心臟畸形發生率低，見圖1。

Figure 1. The changes of fetal cardiac tissues on E12, E15 and E19 in control group and GDM group (HE staining, × 25)．A: blank control group B: GDM group on E15 and E19. a: interventricular septum rupture; b: truncus arteriosus communis; c: ventricular septal defect; d: ventricular chamber dilatation; e: interventricular septum increased thickness; f: myocardial hypertrophy．

GDM組胎鼠心臟組織病理切片可見圓錐干發育畸形(根據文獻報道，圓錐干畸形包括法洛四聯癥、大動脈轉位、動脈單干、右室雙流出道等，本研究中僅發現動脈單干)、室間隔缺損及室間隔裂、心肌壁肥厚、心腔擴大等。高倍鏡下可見GDM組E12胎鼠心肌細胞排列尚整齊，胞漿未見明顯溶解，胞核形態尚規則，但細胞核染色較其它3組深；E15胎鼠心肌細胞排列欠整齊，胞漿稍有溶解，胞核形態不規則，并出現核皺縮等表現；E19胎鼠心肌細胞排列較紊亂，胞漿溶解，成片的無結構區，胞核形態不規則。其它3組心肌細胞呈橢圓形，胞漿豐富，細胞核較大，形態規則，染色均勻，見圖2。

Negative control大鼠胚胎心臟發育情況與blank control組相似，偶見心臟發育畸形的胎鼠，E19見2只心臟畸形胎鼠，主要表現為心肌肥厚及室間隔缺損。

Figure 2. The expression of Hand2 on E12, E15 and E19 in 4 groups (immunohistochemical staining; × 200). Compared with other groups on E12 and E15, the expression of Hand2 in GDM group deceased at the same time points．

Insulin組大鼠胚胎心臟發育情況與blank control組相似，E12、E15和E19均可見胎鼠心臟發育異常，但其發生率不高，與A組相比差異無統計學意義。胎鼠心臟畸形主要表現為心肌肥厚、室間隔缺損及心腔擴大等。

2 各組胎鼠心臟發育畸形的比較

GDM組與其它3組相比較，其心臟畸形發生率明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 胎鼠心臟畸形例數的比較

*P<0.05vsblank control group.

3 免疫組化檢測各組胎鼠心臟組織Hand2 蛋白的表達

免疫組化發現Hand2蛋白主要表達于心臟組織的細胞核中，呈棕黃色顆粒狀。E12時，Hand2主要表達在右心室及大動脈根部；E15時，Hand2蛋白表達增加，并主要表達于右心室區域、主動脈弓及右室流出道等；E19時，Hand2蛋白表達量顯著升高，在右心室、動脈囊和主動脈弓等均表達，在左心室有少量表達。negative control組及insulin組Hand2蛋白定位表達情況與blank control組基本一致。GDM組E12及E15時Hand2蛋白的表達較其它3組明顯下降，E19時Hand2在胎鼠心臟表達量與其它3組相似，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

利用Q-win圖像彩色分析系統進行圖像半定量分析，測定平均灰度值以表示陽性產物的強度?；叶戎翟O定時，把純黑色定義為0，白色定義為255，故灰度值越低，其陽性反應產物的強度越強，即表明Hand2蛋白含量越高。統計結果顯示，與同組各孕齡的平均灰度值相比，E12的平均灰度值最高，即其所表達的Hand2蛋白含量最低，其后依次為E15、E19，3者間差異有統計學意義(P<0.05)；E12時，GDM組平均灰度值高于其它3組，差異有統計學意義(P<0.05)，而3組平均灰度值兩兩比較，無統計學意義(P>0.05)；E15的情況與E12相似，GDM組平均灰度均高于其它3組，且有統計學意義。但E19時，4組心臟組織的平均灰度值差異無統計學意義，見表2。

表2 免疫組織化學檢測Hand2蛋白表達情況

**P<0.01vstinsulin group．

4 各組胎鼠心臟組織中Hand2 mRNA的表達水平

Real-time qPCR分析結果顯示，E12及E15時，GDM組胚胎心臟組織中的Hand2表達與其它3組相比明顯降低，E19時Hand2 mRNA表達水平與其余3組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

Figure 3. Ralative mRNA expression of Hand2 in the myocardial tissues from each group measured by real-time fluorescence quantitative RT-PCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank control group．

5 各組胎鼠心臟組織中Hand2蛋白的表達水平

用Western blotting檢測各組胚胎心臟組織中Hand2蛋白的表達水平，結果顯示GDM組E12和E15時點的Hand2表達減少，差異有統計學意義(P<0.05),見圖4、5。

討 論

GDM是指妊娠期間首次發現或發生的不同程度的糖耐量異常[9]，其發病率在世界范圍不斷上升[10]，對孕母和胎兒均有不良影響，是胚胎期發生心血管畸形的病因之一，有研究提示GDM孕婦胎兒發生心血管畸形的風險是正常孕婦的5倍[11]。糖尿病誘導胚胎畸形的確切機制還不明確，高血糖被認為是對心血管發育造成不利影響的主要原因；在高血糖環境下控制正常心臟神經節發育的基因表達被改變，從而導致中斷心臟神經節的分化[12]。高血糖可使孕婦體內發生各種激素及氧化物代謝紊亂，胎兒發育所需的某些轉錄因子或關鍵基因等物質在這樣的環境下發生質或量的改變，最終導致胎兒先天畸形的發生。在本實驗中，我們觀察到GDM組液化吸收胎、死胎、畸形胎等發育異常胚胎的發生率明顯高于blank control組，GDM組胎鼠心臟發育異常與臨床資料中GDM孕母所致胎兒心臟發育異常的病理類型相符合[13]。同時，我們專門設計insulin組控制血糖在正常范圍內，觀察STZ 藥物本身是否對胚胎發育產生影響，結果insulin組的液化吸收胎的發生率升高，甚至與GDM組相近；而insulin組胎鼠表觀畸形與心臟發育畸形的比例卻遠低于GDM組。這一現象引起了我們的猜測：鏈脲佐菌素藥物本身可能對大鼠早期胚胎發育有一定影響，但其對胚胎心臟等其它器官的發育影響不大。對于這一猜測的真實性，則仍需要我們進一步探討。

Figure 4. The expression of Hand2 protein in embryonic heart tissue detected by Western blotting.

Figure 5. The expression of Hand 2 protein in the fetal rat cardiac tissues from each group measured by Western blotting. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank control group．

bHLH蛋白家族是心臟形成過程中重要的轉錄因子，它將上游誘導信號與下游調控基因聯系起來, 控制心肌細胞的增殖和分化、心臟發育模式及形態發生和心臟收縮[14]。Hand2是bHLH蛋白家族的重要成員，與胚胎心臟發育密切相關。在心管形成前, Hand蛋白首先在心臟前體側壁中胚層、神經嵴和腮弓上表達，然后持續表達于整個心臟發育過程中，直到心腔分化完成。雖然在哺乳動物心臟形態形成和早期胚胎心管不對稱環化過程中Hand1 和Hand2 最初是共同表達的，但隨后Hand1 逐漸主要局限在左心室表達，Hand2 逐漸主要局限在右心室表達[15]。不少學者在雞胚和鼠胚的研究表明[16]，Hand2 在胚胎心臟、血管、肢體等發育過程中扮演重要角色。Liang等[17]研究發現，在斑馬魚中，Hand2不僅在胚胎發育早期的側板中胚層有較強表達，隨著胚胎發育時間的推移，還表達于胚胎的咽弓、心臟和鰭芽。本實驗結果顯示：GDM組及對照組胎鼠心臟中均可檢測到Hand2的表達，E12時Hand2主要表達在右心室及大動脈根部；E15時，Hand2蛋白的表達增加，并主要表達于右心室區域、主動脈弓及右室流出道等；E19時，Hand2蛋白的表達量顯著升高，在右心室、動脈囊和主動脈弓等均表達，表明Hand2在胚胎心臟發育過程中表達呈現上升過程。

孫淑娜等[18]向斑馬魚胚胎注射嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸(morpholino oligonucleotides，MO)抑制Hand2基因的表達后，發現其胚胎心臟發育異常比例顯著升高。Morikawa等[19]指出Hand2基因在神經嵴中的缺失可以導致流出道及主動脈弓動脈的對位不良，導致的心臟畸形表現為肺動脈及右鎖骨下動脈食管后位。GDM組胎鼠心臟畸形的發生率明顯高于其余3組，心臟畸形的種類包括室間隔缺損、圓錐干畸形、心肌肥厚以及心室腔擴大等，與缺乏Hand2導致的心臟畸形種類基本相吻合。

Hand2通過多種信號通路以及與其它基因之間相互作用參與調節胚胎心臟的發育。在老鼠模型中，RRR109-111突變可撤除Hand2 DNA對于熒光素酶報導基因轉錄的結合和活化[20]，造成胎鼠10.5 d死亡和右心室發育異常，提示Hand2可通過依賴結合DNA和獨立的機制來調節體內組織生長和發育[21]。Zhao等[22-23]發現某些microRNA可特異性結合Hand2 mRNA, 阻止其翻譯成蛋白質, 導致胚胎發育初期心肌前體細胞的擴增受限, 進而造成心室沒有足夠心肌細胞而發展為畸形，提示Hand2可通過microRNA在轉錄后翻譯水平調節蛋白合成，從而影響胚胎心臟發育。本實驗表明，E12、E15 GDM 模型鼠的Hand2 mRNA 及蛋白水平較對照組下降(P<0.05)，Hand2基因在妊娠期高血糖環境下發生突變，導致其mRNA及表達產物下調，從而影響了胚胎心臟的發育調控過程，導致先天性心臟缺陷。至于Hand2的表達下調可導致何種類型的心臟發育畸形，它又是通過何種具體途徑導致GDM母親胎兒心臟發育畸形，仍有待進一步研究。

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