柴胡疏肝散通過抗氧化反應對二氯二丁基酯聯合乙醇誘發小鼠胰腺纖維化的防治作用*

張曉芹， 許小凡， 姜婷婷， 陳 瑜， 劉 芳， 史迎莉， 李 濤， 顧 杰， 張 紅△

(陜西中醫學院 1基礎醫學院病理生理學教研室， 2醫學科研實驗中心，陜西 西安 712046)

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是由于長期飲酒或膽道疾患引起的胰腺實質局限性或彌漫性的慢性炎癥，胰腺腺泡和胰島細胞會出現不可逆性損害、萎縮或消失,繼而纖維化，引起不同程度的胰腺內、外分泌功能障礙，嚴重影響患者的生活質量[1]。有效遏制胰腺纖維化，是當前臨床上急需解決的難題。柴胡疏肝散是臨床上用于治療急、慢性胰腺炎的常用方劑，但是該方能否抑制胰腺纖維化及其相關機制目前尚不清楚[2]。本課題采用尾靜脈注射二氯二丁基酯(dibutyltin dichloride, DBTC)聯合10%乙醇飲用復制小鼠慢性胰腺炎模型[3]，給予柴胡疏肝散灌胃，觀察其對慢性胰腺炎小鼠胰腺丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的影響，及防治胰腺纖維化的作用，探討柴胡疏肝散防治胰腺纖維化的作用及機制。

材 料 和 方 法

1 藥品、試劑和儀器

DBTC購于Sigma-Aldrich；柴胡疏肝散由柴胡6 g、赤芍5 g 、枳殼5 g、陳皮6 g、川芎5 g、香附5 g、炙甘草3 g組成，購自陜西中醫學院第一附屬醫院中藥房，加水煎煮2次，過濾去除藥渣，藥液濃縮至70 mL(0.5 kg/L)，分裝后置于4 ℃保存備用。羊抗小鼠β-actin 單克隆抗體購于博奧森公司；羊抗小鼠I型膠原α1鏈(collagen type I alpha 1 chain, COLA1)多克隆抗體購于Santa Cruz；HRP標記的兔抗羊IgG、ECL發光試劑盒和即用型SABC免疫組化試劑盒購于博士德試劑公司；淀粉酶、SOD和MDA試劑盒購于南京建成生物研究所；其它為當地試劑公司提供的最高純度化學試劑；酶標儀(Bio-Tek ELX808IU)；Western blotting電泳轉膜系統(Bio-Rad)。

2 動物、分組及造模

健康昆明小鼠120只(6～8周齡，體重20～28 g),雌雄各半，實驗前置清潔級環境適應性飼養1周，常規飼料，常規飲水，保持室溫在20～25 ℃，12 h晝夜交替，7 d后適應環境，用于實驗研究。小鼠隨機分為3組：空白組、模型組和治療組(每組n=40)。空白組(尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液+正常飲水)；模型組(尾靜脈注射DBTC+飲10%乙醇)；治療組(尾靜脈注射DBTC+飲10%乙醇+柴胡疏肝散)。各組分為造模前及造模后1周、2周、4周、8周5個時點(各時點n=8)。

DBTC 80 mg溶于30 mL無水乙醇，緩慢加入甘油10 mL，再添加生理鹽水至50 mL,搖至清亮(1.6 g/L)，經尾靜脈一次性注射DBTC(8 mg/kg)后加飲10%乙醇飼喂造模。造模后第3天隨機分為模型組和柴胡疏肝散治療組，模型組給予常規飼料和10%乙醇飼喂復制慢性胰腺炎模型[3-4]；柴胡疏肝散治療組造模后72 h開始給予柴胡疏肝散濃縮液(0.5 kg/L)灌胃(生藥6 g·kg-1·d-1)，每天1劑，分別灌胃1周、2周、4周和8周, 治療的同時給10%乙醇繼續飼飲。空白組經尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液(50 μL/10 g體重)，注射后常規飼料及飲水。

3 方法

3.1標本采集與檢測 造模至相應時點麻醉處死動物，經下腔靜脈取血，分離血清；完整摘除胰腺、稱重，將一部分胰腺置于4%中性甲醛溶液浸泡固定，另一部分胰腺迅速置入液氮中，再轉入-80 ℃冰箱，待提取蛋白行Western blotting檢測。

3.2胰腺組織的病理學觀察 一部分胰腺組織經脫水、石蠟包埋、切片，HE染色觀察各組小鼠胰腺組織的形態學改變及纖維化程度。

3.3血清淀粉酶和血清透明質酸的檢測 采用化學比色法檢測血清淀粉酶的水平；采用ELISA法檢測血清透明質酸的變化。

3.4Westernblotting檢測胰腺組織COL1A1的表達 取胰腺組織50mg，加蛋白裂解液400μL勻漿，冰上放置30min，10 000r/min、4 ℃離心10min，提取上清液，采用BCA法進行蛋白定量后，用5×loadingbuffer將樣品稀釋至4g/L；以分子量18～94kD的marker為內參照，SDS-PAGE膠蛋白電泳，電轉移至PVDF膜，封閉液(5%脫脂奶粉)中緩慢搖蕩1h，用TBST洗脫，滴加Ⅰ抗[分別為β-actin(1∶1 000);COL1A1(1∶500)]至PVDF膜，4 ℃搖床上孵育過夜。TBST漂洗3次，每次5min。HRP標記的兔抗羊IgGⅡ抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1h。TBST漂洗3次，每次10min。ECL滴加于PVDF膜上，在暗盒中將X光片曝光，顯影、定影后，根據marker的位置進行掃描與分析。

3.5酶化學法檢測胰腺組織勻漿SOD活性和MDA的水平 取胰腺組織50 mg，加蛋白裂解液400 μL勻漿，制成組織勻漿,采用化學比色法檢測每毫克組織蛋白中SOD活性和MDA水平。

4 統計學處理

數值用均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 10.0統計軟件處理，組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 胰腺組織的病理學變化

DBTC尾靜脈注射聯合飲用乙醇1 d后可見胰腺腺泡細胞腫脹, 間質有大量炎細胞浸潤及少量出血，并可見胰腺腺泡不同程度的片狀壞死；造模后1周可見胰腺明顯腫脹, 大量炎癥細胞浸潤，胰管擴張并可見胰管上皮細胞壞死脫落。2周可見胰腺腺泡細胞明顯萎縮、壞死，大量炎癥細胞浸潤，并出現胰腺實質的少量纖維化；造模后4周可見部分胰腺小葉內腺泡細胞消失，被大量纖維組織所取代，并見大量炎細胞浸潤；8周可見多個胰腺小葉內的腺泡組織及胰島消失，纖維組織廣泛增生呈網格狀分布。而柴胡疏肝散治療組各時點胰腺的炎癥損傷及纖維化程度明顯減輕，見圖1。

2 血清淀粉酶活性變化

DBTC尾靜脈注射后1 d，血清淀粉酶的活性明顯升高；聯合飲用乙醇1周后，血清淀粉酶活性較造模1 d有所回落，但仍高于正常對照組；造模后2周、4周，血清淀粉酶維持在較高水平, 與對照組相比差異顯著(P<0.01)；柴胡疏肝散治療組2周和4周血清淀粉酶活性明顯下降,與相應時點模型組相比有顯著差異 (P<0.05)。造模后8 周血清淀粉酶水平顯著降低，與正常組小鼠相比有顯著差異；而柴胡疏肝散治療組8 周，血清淀粉酶活性沒有出現明顯下降，與模型組相比有顯著差異(P<0.01)，見圖2。

Figure 1. The effect of Chaihushugansan on the pancreatic morphology of mice with chronic pancreatitis (CP) induced by DBTC plus ethanol (HE staining, ×100).

Figure 2. The effect of Chaihushugansan on the amylase activity in the serum of mice with chronic pancreatitis (CP). Mean±SD. n=8.△△P<0.01 vs control; *P<0.05，**P<0.01 vs CP.

3 血清透明質酸的變化

如圖3所示，DBTC尾靜脈注射聯合飲用乙醇2 周、4 周后，血清透明質酸明顯升高, 8 周后進一步升高，與對照組相比差異顯著(P<0.01)；柴胡疏肝散治療組血清透明質酸明顯降低,與相應時點模型組相比有顯著差異 (P<0.01)。

Figure 3. The effect of Chaihushugansan on the hyaluronic acid level in the serum of mice with chronic pancreatitis (CP). Mean±SD. n=8.△△P<0.01 vs control; *P<0.05，**P<0.01 vs CP.

4 胰腺組織Ⅰ型膠原的表達

如圖4所示，對照組小鼠胰腺未見Ⅰ型膠原的表達；DBTC尾靜脈注射聯合飲用乙醇1 周、4周和8周后胰腺Ⅰ型膠原的表達量明顯增加；而柴胡疏肝散治療組各個時點胰腺Ⅰ型膠原的表達量明顯少于模型組(P<0.01)。

Figure 4. The expression of type I collagen in the pancreas following the development of chronic pancreatitis (CP). Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs control；**P<0.01 vs CP.

5 柴胡疏肝散對慢性胰腺炎小鼠不同時點胰腺組織勻漿SOD活性的影響

如圖5所示，DBTC尾靜脈注射聯合飲用乙醇模型組，可見胰腺組織中SOD活性持續降低， 4周和8 周明顯低于正常對照組(P<0.01)。經柴胡疏肝散治療后，胰腺組織SOD活性下降的趨勢減弱，至4 周、8 周胰腺組織SOD活性明顯高于模型組，與相應時點模型組相比有顯著差異(P<0.05)。

Figure 5. The effect of Chaihushugansan on the activity of SOD in the pancreas of mice with chronic pancreatitis (CP). Mean±SD. n=8. △△P<0.01 vs control; *P<0.05，**P<0.01 vs CP.

6 柴胡疏肝散對慢性胰腺炎小鼠不同時點胰腺組織勻漿MDA水平的影響

如圖6所示，DBTC尾靜脈注射聯合飲用乙醇2 周、4 周和8周模型組中，隨時間延長胰腺組織中MDA水平呈逐漸升高趨勢，與正常組比有顯著差異(P<0.01)。柴胡疏肝散治療組MDA水平明顯低于相應時點的模型組(P<0.05)。

Figure 6. The effect of Chaihushugansan on the content of MDA in the pancreas of mice with chronic pancreatitis (CP). Mean±SD. n=8.△△P<0.01 vs control; *P<0.05，**P<0.01 vs CP.

討 論

慢性胰腺炎雖然病因不同、起始步驟各異，但是持續進展的慢性炎癥發展最終導致胰腺腺泡萎縮并逐漸被纖維組織所取代，進行性胰腺纖維化已被看作慢性胰腺炎主要的病理學特征[5]。

目前的研究發現，慢性胰腺炎的病因復雜，我國慢性胰腺炎以膽源性疾病引發的膽管狹窄、梗阻為主要病因，而慢性酒精中毒是西方國家慢性胰腺炎患者的主要病因，近年來酒精引發的慢性胰腺炎在我國也呈現增多趨勢[6]。DBTC是脂溶性物質，尾靜脈注射后在動物體內可經肝臟、膽囊排泄至胰管，引起胰管上皮細胞損傷和壞死增生，壞死的上皮細胞聚集進而造成胰膽管阻塞，類似臨床上的胰、膽管阻塞[7]。Merkord等[3]采用DBTC復制大鼠慢性胰腺炎，同時在飲水中加入乙醇，發現乙醇可以加劇胰腺損傷的強度和進程。DBTC尾靜脈注射聯合飲用乙醇可以誘導大鼠慢性胰腺炎模型已經被多個實驗所證實[3-4]，但是由于小鼠的膽道解剖結構與大鼠有所不同[8]，此種方法是否會誘發小鼠慢性胰腺炎，目前尚不清楚。我們的實驗結果與人類慢性胰腺炎的特征性病理改變相類似[9]，提示DBTC聯合飲用乙醇可以成功復制小鼠慢性胰腺炎模型。

近來研究發現[10-11]，氧化應激與慢性胰腺炎的發生存在密切的關系。MDA是氧自由基攻擊生物膜不飽和脂肪酸的終產物，作為機體脂質過氧化的主要產物，其含量可間接反映機體細胞受氧自由基攻擊的程度[11-12]。SOD是生物體內固有的天然活性蛋白，也是機體內唯一的以自由基為底物的酶類抗氧化劑，能有效清除人體內最主要的自由基，保護細胞免受自由基損傷[12]。

大量研究顯示[13-14]：氧化應激可以促進細胞因子及黏附分子的釋放，增強炎癥細胞的黏附能力，導致炎癥細胞在局部浸潤、聚集、活化，引發局部炎性損傷。而局部浸潤的炎癥細胞不僅可以促進細胞因子的釋放，而且可以促進局部的脂質過氧化反應。由此可見：氧化應激與炎癥反應二者可以相互作用使慢性炎癥得以持續、炎癥損傷不斷加強。另外有研究發現慢性胰腺炎患者的抗氧化能力明顯減弱，抑制氧化應激反應可以有效減輕慢性胰腺炎伴發的疼痛[15]。鑒于大量的數據證實氧化應激在慢性胰腺炎進展中發揮重要作用，探索抗氧化劑對慢性胰腺炎的影響逐漸成為慢性胰腺炎治療學研究中的熱點。

本研究發現，DBTC聯合乙醇造模后1 周、2 周、4 周血清淀粉酶活性明顯升高，但是8周淀粉酶的活性急劇下降，提示胰腺組織廣泛損傷、外分泌能力嚴重破壞。由于血清透明質酸可以反映活動性炎癥導致細胞外基質的動態變化情況，近年來被用于監測組織的纖維化程度[7]。本實驗發現，隨著造模時間的延長，透明質酸的含量不斷升高，胰腺組織Ⅰ型膠原的表達也明顯增強，提示胰腺的纖維化程度不斷加重。造模后2周胰腺組織中MDA的含量明顯升高、4周達到高峰， 而SOD的活性持續降低，提示慢性胰腺炎進展中機體的抗氧化能力不斷減弱，氧化應激不斷增強。同時我們也發現MDA含量的變化與局部組織的炎細胞浸潤程度變化相一致，提示氧化應激與炎癥反應可能通過相互作用促進慢性胰腺炎的進展。

祖國醫學將慢性胰腺炎歸屬于“腹痛、脅痛、泄瀉、癥瘕”等范疇[16]，長期以來認為本病多為恣食肥甘、長期嗜酒、損傷脾胃, 脾胃虛弱, 運化失職；或因砂石阻滯膽道加之情志不暢, 致使肝膽失疏、肝失條達、 疏泄不利、肝氣郁結。脾虛則失于健運，影響肝的疏泄功能，導致氣機郁滯，即脾虛肝郁氣滯。脾為后天之本，氣血生化之源,氣為血之帥，氣行則血行，氣滯則血瘀，故脾虛肝郁氣滯日久會導致血瘀。因此，治療宜用健脾疏肝活血的藥物。柴胡疏肝散由柴胡、陳皮、川芎、香附、枳殼、芍藥、甘草組成，具有疏肝解郁、行氣止痛的功效，近來的臨床實踐表明柴胡疏肝散治療慢性胰腺炎不僅能較好地緩解臨床癥狀，而且能有效地改善預后[17-18]。

本實驗觀察發現，與模型組比較，柴胡疏肝散治療后血清淀粉酶活性、透明質酸的含量明顯改善，胰腺組織炎癥及纖維化程度明顯減輕。胰腺組織MDA在2周明顯回落，并持續維持較低水平，SOD活性呈回升趨勢，提示柴胡疏肝散可以通過提高胰腺組織的抗氧化能力，有效遏制CP病程進展中的氧化應激反應，降低胰腺組織的氧化損傷，進而減輕炎癥反應及胰腺纖維化程度。本研究結果為柴胡疏肝散用于臨床防治慢性胰腺炎提供了實驗依據。

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