EGCG通過mTOR通路拮抗低氧誘導的PC12細胞的凋亡與自噬*

曹錦霞， 王 浩， 王紅衛， 游 詠

(南華大學附屬第一醫院，湖南 衡陽 421000)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是茶多酚的活性成分，越來越多的研究表明，EGCG在神經細胞的修復[1]、對抗氧化應激[2]、抗炎[3]及抑制脂質聚集[4]等多種生物學功能方面具有重要的調節作用。

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一個結構和功能高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，不僅具有調節蛋白質合成的功能[5]，還在細胞增殖分化、凋亡等諸多方面發揮作用[6]。研究已經報道缺氧可導致神經細胞的凋亡并引起細胞自噬[7]。由于mTOR通路發揮多種蛋白表達與功能的調節作用，我們設想mTOR通路可能介導了EGCG對神經細胞的保護作用。

目前，EGCG對低氧誘導的凋亡與自噬方面的研究并未深入展開。EGCG是否能拮抗低氧誘導的神經損傷，以及mTOR通路是否參與其中尚未明了。本研究通過實驗發現mTOR的確介導了CoCl2誘導的低氧所致細胞凋亡與自噬。這些方面的研究結果對于相關藥物走向臨床應用有重要的提示作用。

材 料 和 方 法

1 細胞及培養

PC12細胞購自中國科學院細胞中心，使用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養于37 ℃、5% CO2的培養箱中。取對數生長期的細胞種植于6、 24、 96孔板中進行觀察及相關實驗。

2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測細胞活力

將對數期的細胞均勻種植于96孔板，每個樣本設置3個及以上復孔，每孔加樣100 μL，待細胞貼壁并密度達到75%時，藥物處理24 h。然后每孔加入5 μL的CCK-8試劑。2～4 h后使用450 nm酶標儀檢測各孔吸光度值(A)。

3 細胞形態觀察

將對數期的細胞均勻種植于24孔板，每個樣本設置3個及以上復孔，每孔加樣500 μL，待細胞貼壁并密度達到75%時，藥物處理24 h。然后使用光學顯微鏡觀察細胞形態并拍照。

4 細胞免疫熒光檢測細胞內LC-3的表達

細胞處理24 h后，PBS清洗細胞并用純冰甲醇固定；室溫下Ⅰ抗室溫孵育1 h；然后PBST快速洗2遍，Ⅱ抗避光室溫孵育1 h； PBST快速洗2遍后加入DAPI，室溫孵育2 min后使用熒光顯微鏡觀察，每孔取至少3個視野觀察并拍照。

5 Western blotting檢測beclin-1和mTOR的表達

細胞處理24 h后，提取細胞蛋白并定量。使用濃度為10%、8%的凝膠進行蛋白電泳，電泳完畢使用PVDF膜制作“三明治”采用半干轉法轉膜;轉膜完成后常溫5%脫脂奶粉TBST封閉液封閉1 h;用TBST稀釋Ⅰ抗后搖床上孵育過夜；TBST洗膜3次，Ⅱ抗常溫下搖床孵育2 h;TBST洗膜3次后成像儀顯影。

6 ELISA檢測caspase-3的表達

細胞處理24 h后，提取細胞中的蛋白并定量。按說明書配制好所有的試劑：酶標板每孔加入100 μL的蛋白樣品，覆膜覆蓋后室溫在搖床上孵育3 h，3 h后去除板內液體并在每孔加入300 μL的1×洗滌液，重復2次，然后每孔加入200 μL的1×活性液，在酶標儀使用450 nm波長處讀取A值。

7 統計學處理

所有數據使用均數±標準誤(mean± SEM)表示，使用SPSS 18.0 軟件進行統計分析，組間差異采用單因素方差分析中的最小顯著差異檢驗(LSD)，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 CoCl2誘導的低氧促進了細胞的凋亡及自噬

1.1CoCl2誘導的低氧促進了PC12細胞的凋亡 不同濃度的氯化鈷(CoCl2)處理PC12細胞24 h后，顯微鏡觀察細胞的形態， CCK-8檢測細胞活力，并提取蛋白檢測細胞中caspase-3的表達水平。結果如圖2所示：50、150、250 μmol/L濃度的CoCl2處理后的PC12細胞狀態(可以從細胞形態，貼壁能力及突觸的長度等來評估)明顯下降；細胞活力也隨CoCl2濃度依賴性下降，見圖1A (P<0.01)；凋亡蛋白caspase-3的表達明顯升高,見圖1B(P<0.05)。

1.2CoCl2誘導的低氧促進了PC12細胞自噬的發生 PC12細胞經不同濃度的氯化鈷(CoCl2)處理24 h后，用Western blotting的方法檢測自噬蛋白Beclin-1的表達，并采用蛋白免疫熒光的手段觀察胞核內LC-3的表達情況。由圖1C可以觀察到beclin-1蛋白隨著CoCl2濃度的升高而表達增多，自噬標志蛋白LC-3的表達亦存在相同的趨勢，見圖4(LC-3的表達量通過細胞核內小藍色亮點的數量進行評估)，提示CoCl2誘導的低氧確實促進了PC12細胞自噬的發生。

2 EGCG拮抗低氧誘導的細胞凋亡及自噬

2.1EGCG拮抗低氧誘導的細胞凋亡 通過細胞形態觀察我們可以發現，與對照組相比，150 μmol/L的CoCl2誘導的低氧對細胞狀態有嚴重損傷，而加入不同濃度的EGCG后，細胞狀態較損傷組有明顯好轉，見圖2。單用EGCG則未發現細胞狀態與正常PC12細胞有明顯差異,見圖4。

同時我們使用CCK8檢測細胞活力和ELISA檢測caspase-3表達水平從而對細胞的凋亡程度進行評估，結果顯示與150 μmol/L的CoCl2處理組相比，同時加入不同濃度的EGCG處理后，細胞活力有一定程度的恢復，見圖3A(P<0.01)。相比較于CoCl2處理組，不同濃度的EGCG處理后caspase-3的表達水平有一定程度的下降,見圖3B(P<0.01)。

Figure 1. CoCl2 induced hypoxia promoted apoptosis and autophagy in PC12 at 24 h. A: cell viability was determined by CCK-8; B: caspase-3 was determined by ELISA; C: the expression of beclin-1 was detected by Western blotting using an anti-beclin-1 antibody； D: mTOR expression was detected by Western blotting. Mean±SEM. n=3. * P<0.05, **P<0.01 vs control group (0 μmoL/L).

2.2EGCG拮抗低氧誘導的細胞自噬 我們對150 μmol/L的CoCl2以及不同濃度的EGCG處理PC12細胞24 h后的自噬標志蛋白beclin-1和LC-3進行了檢測，結果顯示：CoCl2單獨處理細胞后的beclin-1表達水平明顯升高，而不同濃度EGCG的處理對beclin-1的表達水平有一定程度的抑制，見圖3C(P<0.05)。從免疫熒光我們可以觀察到與CoCl2單獨處理組相比，加入150 μmol/L的EGCG對細胞核內LC-3的表達有一定程度的抑制，而單獨使用150 μmol/L的EGCG處理的PC12細胞LC-3的表達與對照組無明顯差異,見圖4。

3 EGCG通過調控mTOR通路拮抗低氧誘導的細胞凋亡與自噬

3.1CoCl2誘導的低氧抑制mTOR通路的表達 為明確mTOR對EGCG抗CoCl2誘導的低氧所致的神經毒性的介導作用，我們用不同濃度的CoCl2處理PC12細胞24 h后，Western blotting檢測mTOR的表達，從結果可以觀察到mTOR的表達水平呈濃度依賴性下降，見圖1D(P<0.05)。

3.2EGCG拮抗CoCl2對mTOR通路的抑制作用 PC12細胞同時經過不同濃度的EGCG處理24 h后，mTOR表達水平相較于CoCl2處理組出現濃度依賴性上升，見圖3D(P<0.05)，單獨使用EGCG對mTOR的表達無明顯影響。提示mTOR通路可能參與介導了EGCG抗CoCl2誘導的低氧所致的神經毒性。

3.3雷帕霉素(mTOR特異性阻滯劑)逆轉了EGCG對CoCl2誘導的凋亡與自噬的拮抗作用 上述結果提示mTOR通路可能參與了EGCG抗CoCl2誘導的低氧所致的神經毒性的介導作用，為進一步了解EGCG是否通過mTOR通路發揮作用，我們使用mTOR特異性阻滯劑：雷帕霉素(RAPA)來阻斷mTOR通路，從細胞狀態的結果我們可以發現加入RAPA處理后，EGCG對細胞狀態的改善作用被逆轉;單獨使用RAPA，細胞狀態沒有發生明顯的改變,見圖2。使用RAPA后，用CCK8檢測細胞活力，我們發現加入RAPA處理，PC12細胞的活力較EGCG處理組明顯下降；同時，凋亡蛋白caspase-3的表達水平升高,見圖5(P<0.05)。

加入RAPA處理后，EGCG對細胞自噬的抑制效果也同樣被逆轉。自噬蛋白beclin-1的表達水平較EGCG處理組有一定程度的升高，見圖5C(P<0.05)。同時，RAPA處理后的EGCG組LC-3在細胞核內的表達水平亦出現升高，見圖4。而單用RAPA則對LC-3在細胞核的表達水平與對照組無明顯差異。

Figure 2. Effect of EGCG on hypoxic apoptosis induced by CoCl2 in PC12 cells. PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG and/or RAPA for 24 h (×400). 1: control group; 2: CoCl2 50 μmol/L; 3: CoCl2 150 μmol/L; 4： CoCL2 250 μmol/L； 5：CoCl2 150 μmol/L+EGCG 10 μmol/L； 6： CoCl2 150 μmol/L+ EGCG 20 μmol/L；7: CoCl2 150 μmol/L+ EGCG 40 μmol/L; 8: EGCG 40 μmol/L; 9: CoCl2 150 μmol/L+EGCG 20 μmol/L+RAPA 100 nmol/L; 10: RAPA 100 nmol/L.

討 論

中國人飲茶的習慣最早始于神農時代，時至當今仍然被傳承與發揚。茶葉中主要成分茶多酚的作用越來越得到研究者們的重視，表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為茶多酚生物活性的主要成分，更是當今研究的熱點所在。據報道：EGCG一方面有積極的抗腫瘤作用，例如肺癌[8]、宮頸癌[9]、胃癌[10]及胰腺癌[11]等，另一方面，對正常細胞的抗凋亡等保護預防作用[1]也多有研究。同時，眾所周知，神經細胞缺氧會引起一系列的生理、病理反應，像氧化應激、自噬和內質網應激[12]等，當超過細胞的清除能力時，會引起神經細胞的凋亡[13]，最終導致嚴重的后果。因此，深入闡明缺氧對神經細胞毒性的機制對神經系統相關的疾病防治和人類的健康同樣具有重大的意義。

Figure 3. Effects of EGCG on hypoxic apoptosis and autophagy induced by CoCl2 in PC12 cells. PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG for 24 h. A: the cell viability was determined by CCK-8 assay; B: caspase-3 was determined by ELISA; C, D: the expression of beclin-1 and mTOR was detected by Western blotting. Mean±SEM.n=3.* P<0.05, ** P<0.01 vs control group (0 μmol/L)； #P<0.05, ##P<0.01 vs CoCl2 150 μmol/L group .

Figure 4. Effects of EGCG on hypoxic autophagy induced by CoCl2 in PC12 cells.PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG and/or RAPA for 24 h. The expression of LC-3 was determined by immunofluorescence using an anti-LC-3 antibody. 1: control group; 2: CoCl2 150 μmol/L; 3: CoCl2 150 μmol/L + EGCG 20μmol/L; 4: CoCl2 150 μmol/L + EGCG 20 μmol/L +RAPA 100 nmol/L; 5: EGCG 20 μmol/L; 6: RAPA 100 nmol/L.

EGCG拮抗低氧誘導的細胞凋亡及自噬 PC12細胞來源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，其形態、結構和功能與多巴胺能神經元有一定相似性，廣泛地用于神經細胞的研究。此外，一些研究表明，在許多細胞中CoCl2可以模擬誘導細胞的缺氧環境[14]，如PC12、C6大鼠神經膠質瘤細胞和視網膜神經節細胞[15]。為了明確缺氧對神經細胞的毒性作用，我們采用PC12細胞作為神經細胞模型，不僅觀察了缺氧環境下神經細胞的狀態，還通過細胞活力的檢測和caspase-3的表達水平客觀評估了其凋亡程度，并檢測了細胞中自噬標志性蛋白beclin-1和LC-3的表達，事實上，CoCl2誘導的缺氧確實增加了細胞的凋亡，并上調了細胞的自噬作用。其它相關研究也證實，CoCl2誘導的缺氧可以導致神經細胞的凋亡[5]、氧化應激及內質網應激[16]的發生。這些研究結果都與我們對缺氧環境對細胞凋亡和自噬增強的實驗結果與預期一致。

EGCG通過調控mTOR通路拮抗低氧誘導的細胞凋亡與自噬，mTOR是一個結構和功能高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以調節蛋白質的合成，并影響細胞的增殖、凋亡，同時在細胞的抗氧化應激、自噬等生物學功能中發揮作用[17]。我們通過檢測mTOR在CoCl2誘導的缺氧環境以及EGCG處理后的表達發現：CoCl2誘導的缺氧抑制了mTOR的表達，而EGCG則恢復了其活性，說明mTOR介導了CoCl2誘導的缺氧對神經細胞毒性。

Figure 5. Effects of RAPA on EGCG-induced downregulation of apoptosis in PC12 cells. PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG and/or RAPA for 24 h.A: the cell viability was determined by CCK-8 assay; B:caspase-3 was determined by ELISA;C: the expression of beclin-1 was detected by Western blotting. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs control group；# P<0.05, ## P<0.01 vs CoCl2 150 μmol/L group.

阻斷mTOR通路后EGCG是否能拮抗CoCl2誘導的低氧所致的神經毒性？為了得到答案，我們采用mTOR特異性阻滯劑雷帕霉素功能處理細胞后，結果提示細胞凋亡增加，凋亡蛋白caspase-3表達增多；自噬水平升高，自噬標志蛋白beclin-1和LC-3表達均升高，說明mTOR通路阻斷后，加重了CoCl2誘導的低氧所致的神經毒性，抵消了EGCG拮抗低氧所致的細胞損傷，EGCG通過調控mTOR通路發揮抑制凋亡、降低自噬的生物學作用，從而拮抗低氧所致的神經毒性。

值得注意的是，通過觀察阻斷mTOR通路表達的結果，我們發現加入RAPA阻斷mTOR通路后相比于對照組并未完全抑制PC12細胞的活力，并且自噬水平下降的程度有限，這提示我們可能還存在其它的通路使得EGCG發揮其抗凋亡，抑制自噬的生物學作用。

通過研究，我們證實了EGCG通過mTOR通路拮抗CoCl2誘導的低氧引起的PC12細胞的凋亡與自噬。這為缺氧的神經毒性機制的研究提供了新的線索和思路，基于目前的研究，運用EGCG治療神經細胞缺氧所致的損傷或許是新的途徑與策略，同時，這對于神經系統相關疾病的研究與治療也開辟了新的視角。

[參 考 文 獻]

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