siArid2重組腺病毒載體的構建及其對肝癌細胞增殖的影響*

段玉潔， 聶麗珠， 田 玲， 李 治， 陳 震， 唐 霓

(重慶醫科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶 400016)

Arid2 是近年來新發現的一個抑癌基因，定位于第12對染色體的長臂上，包含21個外顯子[1],其編碼的蛋白是PBAF(polybromo-associated BRG1-associated factor)復合物的一種特有亞基，而PBAF是一種依賴ATP酶的染色質重塑復合物，可以通過水解ATP獲得的能量, 改變組蛋白與核小體之間的相互作用,調控細胞的增殖和分化過程。

Arid2蛋白結構分為N端富含保守AT的結構域，RFX型翼狀螺旋DNA結合域，富含脯氨酸、甘氨酸的結構域以及C端2個保守鋅指結構域[2]。人類Arid家族包含15個成員，可分為7個亞家族：Arid1～5、JArid1和JArid2[3]。研究表明Arid家族的突變失活與人類多種腫瘤如肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、黑色素瘤、非小細胞型肺癌以及頭頸部癌等的發生發展密切相關[4]。據統計，在丙型肝炎病毒(HCV)感染相關的HCC中，約18.2%的HCC組織標本存在Arid2 的失活突變。

研究表明Arid2等組成的蛋白復合物SWI/SNF具有腫瘤抑制作用，被認為是一類腫瘤抑制因子或抑癌基因，可能通過以下途徑發揮作用：(1)調控IFN信號通路，調節宿主的免疫應答；(2)調控pRb信號通路下游靶基因，抑制細胞增殖；(3)調控細胞骨架蛋白、跨膜糖蛋白CD44等參與調控細胞的遷移與侵襲力[5]。Arid2的生物學功能尚不明確，其在腫瘤發生發展特別是肝細胞肝癌中的作用目前知之甚少。

小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)是含有21～23個堿基的單鏈或雙鏈RNA，能夠高效、特異地與目標mRNA位點結合，促使同源mRNA降解，從而特異地下調甚至沉默目標基因的表達[6]。本研究運用小干擾RNA技術構建沉默Arid2 的重組質粒，并將質粒包裝成腺病毒[7]，通過體外實驗初步分析該基因的功能，為今后的實驗研究奠定基礎。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1質粒、細胞 pSES-1穿梭質粒載體、BJ5183菌株及其衍生物AdEasy-1細胞、腺病毒骨架質粒pAdEasy-1和含有無關序列(scrambled)的siRNA腺病毒Adsicontrol均由美國芝加哥大學分子腫瘤實驗室HE Tong-chuan教授惠贈；人腎上皮細胞HEK293和人肝癌細胞SMMC-7721為本實驗室保存；HEK293細胞培養在含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素+鏈霉素)的DMEM培養基，SMMC-7721細胞培養在含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素+鏈霉素)的1640培養基中。

1.2主要試劑 限制性內切酶HindIII、KpnI和SfiI購于New England Biolabs；T4 DNA連接酶和質粒小量提取試劑盒購于Promega；DNA marker購于TaKaRa；轉染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen；蛋白定量試劑盒購于碧云天公司；Arid2單克隆抗體(兔)購于Santa Cruz；鼠抗IgG-HRP、山羊抗兔多克隆Ⅱ抗IgG購于Abcam；ECL發光試劑購于Millipore；胎牛血清購自Gibco；雙抗(青霉素+鏈霉素)、DMEM和1640培養基購自Hyclone。

2 方法

2.1siArid2腺病毒穿梭質粒的構建 根據PubMed公布的Arid2基因序列設計3對siRNA，見表1，將3對正、反義鏈引物按照1:3稀釋，分別等比例混勻后，沸水煮沸10 min，自然冷卻至室溫以便形成發夾式結構的雙鏈DNA。用限制性內切酶SfiⅠ酶切載體pSES-1使其線性化，用T4 DNA連接酶將上述引物與線性化的載體連接，電轉入感受態菌DH5α中，鋪板后置于37 ℃孵箱中過夜。挑取陽性單克隆菌落，提取質粒后送華大基因進行測序分析，測序結果成功獲得重組質粒psiArid2-1、psiArid2-2和psiArid2-3。

表1 引物序列

2.2siArid2腺病毒的構建 將重組質粒psiArid2-1、psiArid2-2和psiArid2-3分別用限制性內切酶PmeI酶切，使其線性化，再電轉入腺病毒同源穿梭質粒BJ-AdEasy中，電轉產物涂于含100 mg/L卡那霉素的LB平板上，于37 ℃孵箱中孵育過夜，在LB平板上挑取約20個偏小的單克隆菌，接種于 4 mL 含100 mg/L卡那霉素的LB培養液中，37 ℃搖床過夜培養。用堿裂解法小量抽提質粒，將提取的質粒在0.8%瓊脂糖凝膠電泳，根據質粒大小篩選出陽性克隆質粒pAdsiArid2-1～3。將上述質粒電轉入感受態菌E.coliDH5ɑ中擴大培養，將提取的重組腺病毒質粒進一步用限制性內切酶PacⅠ進行酶切鑒定。

2.3重組腺病毒的包裝擴增 用小量抽提試劑盒提取pAdsiArid2-1～3質粒，PacⅠ酶切后無水乙醇沉淀法純化。用3 mL無血清培養基輕輕洗滌HEK293細胞，吸去培養基，再加入2.5 mL無血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2濕度孵箱中。將13 μL脂質體，3 μg AdEasy-siArid2質粒和250 μL無血清的DMEM培養基混勻，室溫靜置15～17min后加入到培養基中，輕輕混勻，于37 ℃、5%CO2濕度孵箱中孵育4 h。吸去轉染液，加入7 mL含10%胎牛血清的完全培養基繼續培養。48 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光情況。轉染成功后約10～15 d，收取含病毒的上清，用約1/2的量繼續感染293細胞，進行新的一輪病毒擴增，重復擴增4～5次后獲得滴度較高的重組腺病毒，保存至-80℃。

2.4siArid2腺病毒的鑒定和效率測定 將SMMC-7721細胞以每孔40%的密度接種于24孔培養板中，設置6個復孔。將3種重組腺病毒以10 μL為初始量按1/2等比減量后依次加入6個孔中，即相應的6個孔中所加入的腺病毒量為10μL、5μL、2.5μL、1.25μL、0.75μL和0.37μL)。顯微鏡下觀察細胞生長狀態以及熒光強弱，選擇細胞狀態良好、熒光強度適中的孔所對應的病毒量作為重組腺病毒的最適滴度。將4×105SMMC-7721細胞接種于10 cm培養皿中，待細胞貼壁后分別感染最適滴度的重組腺病毒AdsiArid2-1、AdsiArid2-2、AdsiArid2-3以及對照腺病毒Adsicontrol。病毒感染后48 h分別提取總蛋白，并用BCA法測定其蛋白濃度。取50 μg蛋白，經10% SDS-PAGE分離后，轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。按照抗體說明書將膜孵以最適稀釋度的Arid2抗體，4 ℃ 孵育過夜。TBST洗膜40 min后，加入1∶5 000稀釋的羊抗兔Ⅱ抗室溫孵育1 h。TBST洗膜后，加入ECL發光試劑，用ImageJ 2X灰度比對軟件分析各組Arid2的表達情況。實驗重復5次。

2.5MTS法檢測SMMC-7721細胞的生長 將4×105SMMC-7721細胞接種于10 cm培養皿中，待細胞貼壁后分別感染最適滴度的重組腺病毒Adsicontrol和AdsiArid2，同時設置空白對照組。病毒感染后12 h，將上述細胞以4×103/well密度重鋪于96孔培養板中，每組設3個復孔，分別于鋪板后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h向每孔加入20 μL MTS反應液，輕輕混勻，于37 ℃、5%CO2孵箱中避光靜置2 h，檢測各時點的吸光度(A490)。實驗重復3次。

2.6流式細胞儀檢測細胞周期 將2×104SMMC-7721細胞接種于6 cm培養皿中，待細胞貼壁后分別感染最適滴度的重組腺病毒Adsicontrol和AdsiArid2，同時設置空白處理組作為對照。病毒感染后12 h，更換新鮮的細胞培養基，72 h后棄去培養基，并用預冷的PBS洗滌細胞2次，加入75%的乙醇輕輕重懸收集細胞。-20 ℃固定細胞24 h，取等體積的碘化丙啶染液與細胞懸液混合后，4 ℃靜置30 min,通過流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復3次。

3 統計學處理

每種實驗均進行至少3次獨立重復實驗。用SPSS 19.0統計軟件分析實驗結果。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，各組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 siArid2腺病毒重組質粒的構建和鑒定

將構建好的3個重組質粒psiArid2-1～3電轉入BJ-AdEasy感受態細胞，挑取轉化菌落進行搖菌，提取質粒DNA。由于腺病毒的同源重組可以發生在穿梭質粒AdEasy-1的ori區域之間或者其左臂上，這2種重組方式導致限制性內切酶PacI酶切后會產生3.0 kb或4.5 kb的片段。用PacI 酶切后2號、5號和8號重組菌落出現約4.5 kb DNA條帶，表明腺病毒重組質粒構建成功，見圖1。

Figure 1. Identification of recombinant adenoviruses by Pac I digestion.Three of the 9 potential clones released a 4.5-kb fragment after Pac I digestion(Lane 2,Lane 5 and Lane 8).M: DNA marker 2000.

2 siArid2重組腺病毒的構建

將已構建好的pAdsiArid2-1～3重組質粒用脂質體法分別轉染HEK293細胞，48 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞的感染情況。在轉染后7 d，上述細胞中均可見明顯的紅色熒光，且呈現腺病毒包裝過程中出現的典型“彗星狀”熒光，隨著轉染天數的增加，熒光強度增強，約轉染后10 d，部分細胞由貼壁轉為漂浮，大約14 d后，收集含病毒顆粒的上清,見圖2。

3 鑒定重組干擾腺病毒的抑制效率

將SMCC-7721細胞分別感染重組腺病毒AdsiArid2-1～3，并設置空白對照組和Adsicontrol組，細胞感染后48 h收集總蛋白，行Western blotting實驗檢測Arid2蛋白的表達水平,實驗重復5次。結果顯示：以GAPDH為內參照，AdsiArid2-1組的灰度比值為0.749±0.020，AdsiArid2-2的灰度比值為0.473±0.028，AdsiArid2-3的灰度比值為0.415±0.017，空細胞(mock)和Adsicontrol組的灰度比對值分別為0.772±0.031、0.783±0.018。統計分析顯示，mock組與Adsicontrol組的Arid2表達量無明顯差異，與Adsicontrol組相比，AdsiArid2-2和AdsiArid2-3對Arid2的表達均有明顯抑制作用(P<0.05)，其中以AdsiArid2-3的抑制作用更強，而AdsiArid2-1的抑制作用不明顯(P>0.05)。以上結果表明AdsiArid2-3沉默Arid2表達的效果最好。因此，在后續MTS和細胞周期實驗中選擇AdsiArid2-3作為實驗組,見圖3。

Figure 2. Package of recombinant adenoviruses in HEK293 cells.Transfected HEK293 cells were observed under fluorescence field at 10 d(×400).

Figure 3. Arid2 protein expression in SMCC-7721 cells transfe-cted with Adsicontrol,AdsiArid2-1, AdsiArid2-2 and AdsiArid2-3.Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs Adsicontrol group; #P<0.05 vs mock group.

4 siArid2對于SMCC-7721細胞增殖活性的影響

MTS結果顯示，AdsiArid2組在72 h和96 h的吸光度值分別為1.13±0.05和1.23±0.04，mock組72 h和96 h的吸光度值分別為0.92±0.03和1.07±0.08，Adsicontrol組72 h和96 h的吸光度值分別為0.91±0.01、1.03±0.02。通過以上數值可以看出AdsiArid2組在72 h和96 h的吸光度值與對照組相比明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)，說明沉默Arid2基因的表達可以促進肝癌細胞的增殖，見圖4。

Figure 4. The effects of recombinant adenovirus on the proliferation of SMMC-7721 cells.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs Adsicontrol group;#P<0.05 vs mock group.

5 siArid2對于細胞周期的影響

流式細胞術的分析結果顯示，感染腺病毒72 h后，AdsiArid2組SMMC-7721細胞處于G1期和S期的百分比分別為55.67%±0.38%和31.93%±0.38%；mock組處于G1期和S期細胞百分比分別為63.57%±2.90%和24.75%±2.53%；而Adsicontrol組處于G1期和S期細胞百分比分別為66.02%-2.13%和24.37%±1.91%。從以上數值可以看出，感染AdsiArid2腺病毒組，SMMC-7721細胞G1期縮短,S期延長，細胞處于活躍增殖狀態，細胞周期進程加快，見圖5。

Figure 5. The percentage of cell phase.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs Adsicontrol group.

討 論

HCC是全球最常見的十大惡性腫瘤之一，在我國，肝癌死亡率已居癌癥死亡率的第二位[1]。癌癥的發生發展是一個多因素作用的過程，包括細胞分子信號轉導通路的激活、原癌基因與抑癌基因的失衡以及腫瘤干細胞的分化等。其中抑癌基因的失活一直在癌癥研究中受到重視[8]。

Arid2，存在于PBAF復合物中，而PBAF復合物是SWI/SNF復合物的一種類型。SWI/SNF復合物是一種ATP依賴的染色質重塑復合物，它可以利用催化ATP水解釋放的能量改變組蛋白與DNA之間的相互作用來調整染色質的結構，這對于轉錄活動的順利進行具有重要意義[9]。功能學研究顯示，Arid2是PBAF復合物中唯一的短半衰期轉錄因子，通過小干擾RNA抑制Arid2的表達可以降低PBAF復合物中其它蛋白的表達[10]。Arid2被發現在肝細胞癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、非小細胞肺癌和乳腺癌中均存在不同程度的突變[11-13]，其中在丙型肝炎病毒相關的HCC中存在3種形式的突變：移碼突變、無義突變和剪接位點突變[1]。Arid2的突變失活能否影響肝癌的發生和發展過程，可能發揮作用的機制，目前的認識與研究都知之甚少。因此本研究旨在通過小干擾RNA技術構建siArid2的重組腺病毒，初步觀察其對于細胞生長及細胞周期的影響，為之后更加深入地研究Arid2的抑癌機制提供重要的前期工作基礎。

通過分析Arid2編碼區序列，我們設計了3段編碼區的siRNA片段，分別構建3個siArid2的重組質粒，并進一步構建了其重組腺病毒，且通過Western blotting我們篩選出了抑制效果最明顯的重組腺病毒AdsiArid2-3。將該腺病毒感染體外培養的SMMC-7721細胞后，在72 h和96 h時細胞的吸光光度值(A值)較對照組顯著增加，說明沉默Arid2的表達可以促進肝癌細胞的生長。Arid2參與調控細胞增殖的具體機制尚不明確。有研究表明，Arid家族其它成員如Arid1A、Arid1B可以通過與E2F-Rb信號通路相關分子相互作用調控細胞周期進程，從而參與調節細胞的生長與增殖[14]。細胞周期分為G0/G1、G2、S和M四個周期，各期都存在關鍵的檢測點，例如G1/S和G2/M檢測點。各檢測點功能正常可以保證細胞周期順利進行。其中，G1/S檢測點在細胞周期進程中起關鍵作用，決定細胞周期能否啟動進行細胞增殖[15-17]。通過流式細胞學分析，SMCC-7721細胞在感染重組腺病毒AdsiArid2后，G0/G1期細胞百分比減少，S期細胞百分比增加，與對照組相比有統計學差異，提示Arid2有可能通過調控肝癌細胞的細胞周期，從而抑制肝癌細胞的增殖。

綜上所述，本實驗成功構建了沉默Arid2表達的重組腺病毒，初步觀察了Arid2對肝癌細胞生物學功能的影響，對于Arid2是如何調控肝癌細胞的生物學功能及其相關的分子機制，還需進一步深入研究。

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