華支睪吸蟲膜抗原/排泄分泌抗原酸性磷酸酶的克隆、表達、生物學特征分析及組織定位*

鄭明慧， 胡坤華， 張 彤， 劉 煒， 余新炳

(1中山大學孫逸仙紀念醫院檢驗科，廣東 廣州 510120；中山大學中山醫學院 2熱帶病防治重點實驗室，病原生物學教研室， 3藥理學教研室，廣東 廣州 510080； 4中山大學第三附屬醫院廣東省肝病重點實驗室，廣東 廣州 510630)

華支睪吸蟲(Clonorchissinensis，C.sinensis,Cs)也稱肝吸蟲，廣泛分布于亞洲地區，包括中國、韓國、朝鮮、日本及東南亞等，可引起宿主的膽石癥、膽管炎、肝纖維化、肝硬化及肝膽管癌等，是一種重要的食源性寄生蟲病[1]。

寄生蟲的排泄分泌產物(excretory-secretory pro-ducts，ESP)參與寄生蟲與宿主的相互作用[2]， 具有重大的臨床診斷意義和臨床病理意義。 ESP 在華支睪吸蟲幼蟲移行至肝膽管致肝膽管癌方面起重要作用[3]。寄生蟲的排泄分泌抗原(excretory-secretory antigens, ESA)是蟲體與宿主密切接觸的媒介之一，其釋放到蟲體外寄生部位與宿主細胞如肝星狀細胞、膽管上皮細胞甚至肝細胞直接接觸而引起一系列的生物效應，蟲體及其分泌排泄成分可造成膽石癥、肝膽管炎、肝纖維化、肝硬化及肝癌等[1]。

寄生蟲的膜抗原:吸蟲具有相同的皮層結構, 最外一層是沒有細胞間隔的合胞體, 皮層表膜是合胞體細胞膜, 是蟲體與外界環境進行物質交換的一個重要界面, 許多營養物質的攝取和胞內代謝終產物和其它有毒物質的排出需要通過表膜上的協助因子來完成[4]。

酸性磷酸酶(acid phosphatase, AP)分布很廣, 從低等生物大腸桿菌、酵母到高等動植物組織、體液以及人類肝臟、前列腺都存在[5]。AP參與磷酸酯代謝、代謝調節、能量轉換以及信號轉導等[6]。

那么， 華支睪吸蟲酸性磷酸酶具有哪些生物學特征，其在蟲體代謝及致病中起什么作用，其是否為華支睪吸蟲膜抗原/排泄分泌抗原，目前尚缺乏充分研究。

本研究目的是對華支睪吸蟲膜抗原/排泄分泌抗原酸性磷酸酶基因進行克隆、表達、生物學特征分析及組織定位。

材 料 和 方 法

1 CsAP生物信息學分析

從華支睪吸蟲成蟲cDNA質粒文庫中尋找C.sinensisESA酸性磷酸酶(CsAP)全長序列。以生物信息學進行全長分析(Vector NTI Suite 8.0)、理化性質分析、信號肽分析及跨膜結構預測。

2 CsAP克隆、表達和純化

CsAP序列的編碼區(不包含信號肽)以上游引物(5’-AAA GAT ATC GGG GCG ACC AAC GTT CT-3’)及下游引物(5’-GGG AAG CTT TTA AAA TGT GGG GTT CAG TTG-3’)進行PCR擴增，擴增條件為：95 ℃ 1 min, 58 ℃ 1 min, 72 ℃ 80 s, 35 個循環 (TaKaRa)，以EcoR Ⅴ 及HindⅢ雙酶切并純化后，重組入帶有6×His-tag的 pET-30a 表達載體 (Novagen)，以1 mmol/L IPTG于37 ℃、4 h誘導表達 (包涵體形式表達)。8 000×g、4 ℃離心10 min,收集菌體，以SDS-PAGE分離并收集重組融合蛋白，以銅染試劑盒(Bio-Rad)染色，切割目的蛋白條帶并進行電洗脫[7-8]，親和層析純化后 (Novagen)，PBS (pH 7.4)透析濃縮后Bradford定量分析[9]，行SDS-PAGE及Western blotting分析其完整性。

3 C. sinensis 排泄分泌抗原、粗抗原及膜蛋白的制備及GST標簽蛋白的純化

將活動良好的、完整的華支睪吸蟲成蟲以DMEM (Gibco)于37 ℃、5% CO2無菌培養3 h，收集培養液上清為分泌排泄抗原，透析濃縮后-80 ℃保存備用[10]。C.sinensis成蟲以PBS勻漿，10 000×g、4 ℃離心15 min, 收集上清為粗抗原，-80 ℃保存備用。以膜蛋白提取試劑盒(Calbiochem)提取C.sinensis成蟲膜蛋白-80 ℃保存備用。

pGEX-4T-1質粒轉化入感受態細胞DH5α并進行培養擴增其拷貝數, 提取質粒轉化入BL21(DE3)以IPTG 誘導標簽蛋白表達，以GST-bind純化試劑盒 (Novagen)進行標簽蛋白純化, PBS中進行透析, 視情況進行濃縮，存于-20 ℃備用。

4 抗血清制備

CsAP (每只200 μg)與等體積福氏完全佐劑混勻，給SD大鼠皮下多點注射免疫，間隔2周進行第2次加強免疫(每只100 μg,加等體積不完全福氏佐劑)；再間隔2周用上述方法進行1次加強免疫。末次免疫后2周大鼠眼球采血，分離血清，ELISA法測抗體效價后保存于-80 ℃備用。抗CsESA血清制備方法同上。

5 Western blotting分析

SDS-PAGE (15%)分析CsAP及CsESA, 電轉移至PVDF膜(Qbiogene)，以CsAP及CsESA抗血清、感染C.sinensis大鼠血清及正常大鼠血清分別進行免疫印跡識別；同上述方法，以CsAP抗血清、感染C.sinensis大鼠血清及正常大鼠血清分別進行免疫印跡識別C.sinensis膜蛋白；6×His單克隆抗體 (Boster Co.) 分別進行免疫印跡識別CsAP及含有pET30a 的BL21；然后，以HRP標記的兔抗大鼠或兔抗小鼠IgG (Boster Co.)作為Ⅱ抗，以二氨基聯苯胺為底物顯色。

6 CsAP于 C. sinensis 各發育階段免疫組化定位

將從感染華支睪吸蟲動物體內分離的成蟲及囊蚴固定后制作石蠟切片，尾蚴、雷蚴活體以丙酮固定。脫蠟后的石蠟切片和活體玻片以自發熒光淬滅劑(Applygen)處理，PBS-T清洗后，以10% BSA 的PBS 4 ℃封閉過夜。PBS-T清洗后，以CsAP的抗血清孵育室溫1h, 同樣方法以大鼠免疫前血清為對照。PBS-T清洗后，以FITC標記的Ⅱ抗goat anti-rat IgG (1∶400) (Invitrogen)室溫孵育30 min。PBS-T清洗后，熒光顯微鏡拍照(Olympus IX61)。

7 健康及C. sinensis感染、日本血吸蟲(Schistosoma japonicum， S.japonicum, Sj)感染人血清

73份感染C.sinensis、50份感染S.japonicum病人血清及35份健康人血清檢測診斷抗原特異性；以CsAP分別檢測不同蟲荷的C.sinensis病人血清(EPG<1 000 14份、EPG 1 001～5 000 50 份、EPG 5 001～10 000 18 份病人血清)和35份健康人血清檢測診斷抗原敏感性。

8 明膠酶譜法分析CsAP降解膠原能力

(1)調整CsAP、CsMAP-2(作為重組蛋白對照)、牛血清白蛋白和GST (作為對照)蛋白濃度調整使所上蛋白總量一致。與4×上樣緩沖液(4% SDS，0.25 mmol/L Tris-HCl，40% 甘油，0.1% 溴酚藍)按照1∶3混合。(2)配制分離膠和濃縮膠，4 ℃進行SDS-PAGE 100 v 恒壓跑至分離膠和濃縮膠交界處改為90 mA恒流，直至溴酚藍跑出膠外。(3)凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100，50 mmol/L Tris -HCl，5 mmol/L CaCl2，1 μmol/L ZnCl2，pH 7.6) 中振蕩洗脫2次,每次45 min, 然后用漂洗液(除不含Triton X- 100 外其余同洗脫液) 漂洗2次,每次20 min, 接著,將凝膠置于孵育液(50 mmol/L Tris-HCl, 5 mmol/L CaCl2, 1 μmol/L ZnCl2, 0.02% Brij-35, pH 7.6) 中37 ℃ 孵育42 h。(4)染色液(0.05% 考馬斯亮藍、30%甲醇、10%乙酸) 染色3 h,及脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%和10%,乙酸濃度分別為10%、10%和5%) 分別脫色后，顯示位于藍色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統拍照分析。

9 ELISA

包被緩沖液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液， pH 9.6)將CsAP稀釋至10 mg/L，0.1 mL/well于96孔酶標板，4 ℃過夜。次日用PBS-Tween 20(PBS溶液中含0.05% Tween 20，PBS-T)洗滌3次，每次5 min。5%脫脂奶粉37 ℃、2 h封閉，PBS-T洗滌后加1∶200稀釋的待檢樣品0.1 mL于包被反應孔中，37 ℃孵育2 h。另設空白、陰性對照。PBS-T洗滌3次后，每孔加入1∶20 000 HRP標記的兔抗大鼠IgG，37 ℃孵育1 h。洗滌后，每孔加入TMB溶液(BD Biosciences)，顯色5～10 min。每孔0.05 mL中加入2 mol/L硫酸。全自動酶標儀檢測儀(Labsystems Dragon, Multiskan MK3)于450 nm測A值。Cut-off 值=正常人血清A值均值+2倍標準差。

10 統計學處理

用SPSS 14.0軟件進行統計分析。數據使用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗方法，以P<0.05為差別有統計學意義。

結 果

1 CsAP生物信息學分析

CsAP全長1 816 bp,編碼區為68～1 477，在5’端和3’端都有非翻譯區，該基因為全長基因。CsAP的ORF共有1 410 bp，編碼470個氨基酸，預測分子量為55.3 kD, 第1～27位氨基酸為分泌信號肽序列。其跨膜區包括第6～29位氨基酸由內向外的跨膜區和第426～450位氨基酸由外向內的跨膜區，見圖1。

2 CsAP在大腸桿菌BL21 E. coli表達與純化

成功構建于pET-30a原核質粒，于BL21E.coli表達,CsAP菌體沉淀中有目的條帶表達，包涵體經洗滌后，以SDS-PAGE分離，以銅染試劑盒染色，切割目的蛋白條帶并進行電洗脫，親和層析純化后得到分子量為55.3 kD的目的條帶，見圖2A。

3 CsAP重組蛋白Western blotting分析

CsAP蛋白分子量均與理論分子量相符，可被His單抗識別及其抗血清識別其單體及二聚體，并可被抗CsESA及抗CsAP的多克隆抗體分別識別其單體及二聚體;CsESA可被抗CsESA的多克隆抗體識別, 并可被抗CsAP的多克隆抗體識別其單體及二聚體[11]，見圖2B。

C.sinensis成蟲膜蛋白可被C.sinensis感染大鼠血清識別，識別抗CsAP的多克隆抗體識別; 與跨膜結構預測結果一致，見圖2C。

Figure 1. Bioinformatics analysis of CsAP. Nucleotide sequence and the deduced amino acid squence of the CsAP cDNA. The location of the N-terminal signal sequence was underlined. And the locations of transmembrane domains were framed.

4 免疫熒光分析CsAP重組蛋白在C. sinensis的組織定位和發育時期定位

免疫組織化學定位顯示CsAP熒光顯示于成蟲的表皮層和腸支，在囊蚴也有顯示，在雷蚴和尾蚴未顯示熒光，CsMAP-2(作為重組蛋白對照)可定位于雷蚴，在尾蚴未顯示定位，見圖3。CsAP組織定位于成蟲的表皮層，與生物信息學預測膜蛋白結果一致。

Figure 2. Cloning, expression and identification of recombinant CsAP. A: expression and purification of CsAP; B: identification and antigenicity of recombinant CsAP; C: transmembrane domains prediction by TMpred (left) and identification by Western blotting (right) for CsAP.

Figure 3. Immunohistochemistry staining of CsAP localization.A: immunofluorescence for CsAP localization in C. sinensis adult (×100) and metacercaria (×200). i: intestine; T: tegument and tegumentary cells. B: immunofluorescence for CsAP localization in C. sinensis cercaria and redia (×100).

5 CsAP對膠原的降解作用

CsAP 在其分子量相應位置顯示清晰的膠原降解負染條帶，而對照重組蛋白(包涵體復性)CsMAP-2未顯示明顯的膠原降解負染條帶，表明CsAP包涵體復性較為成功，見圖4。

Figure 4. Gelatin zymography assay of CsAP.A: SDS-PAGE identification of CsMAP-2(recombinant protein as control), CsAP and the controls (BSA and GST); B: collagen-containing native PAGE identification of the collagen degradation effect of CsMAP-2(recombinant protein control), CsAP and the controls (BSA and GST).

6 CsAP重組蛋白ELISA分析

ELISA分析表明CsAP識別華支睪吸蟲病人和日本血吸蟲病人存在交叉免疫識別(P>0.05)；CsAP及粗抗原識別輕、中、重度感染程度的華支睪吸蟲病人的差別不明顯(P>0.05)。CsAP總IgG抗體滴度于3周達高峰，抗體效價均大于1∶25 600，見圖5。

Figure 5. ELISA analysis of CsAP. A: immunoreactivity of the recombinant CsAP and the crude antigens against serum samples from patients infected with C.sinensis (Cs) and S.japonicum (Sj), and healthy persons (control); B: immunoreactivity of the recombinant CsAP against serum samples from different fluke burden patients infected with C.sinensis; C: antibody development curves of IgG antibody of CsAP.

討 論

在本研究中，重組、表達、純化了一個屬于組氨酸酸性磷酸酶家族的CsAP，生物信息學預測其具有跨膜結構域及信號肽，故推測其為膜抗原及分泌排泄抗原。

生物信息學分析跨膜蛋白預測、膜蛋白免疫印跡分析表明，CsAP是蟲體膜抗原及ESA的成分之一。其組織定位于蟲體表膜及腸支，表膜是蟲體與外界溝通的重要媒介，其交叉免疫反應廣泛存在于蠕蟲間，故不是華支睪吸蟲病的特異性診斷抗原；而腸支是蟲體分泌排泄的重要途徑，可能參與華支睪吸蟲致肝纖維化的過程[1]。同時，免疫組化分析表明，CsAP在囊蚴也有顯示，在雷蚴和尾蚴未顯示熒光，推測其可能選擇性表達于成蟲及囊蚴階段，有利于其對宿主的免疫逃避[12]。

AP存在于細胞溶酶體中，其活性在正常情況下相當穩定,當受到不良因素影響時,其活性增強,一方面吞噬消化變性壞死結構, 另一方面水解正常細胞結構,加速細胞變性壞死過程[13],肝細胞受損時,此酶活性增高，可降解成纖維細胞產生的膠原[14-15]。本研究中的膠原降解實驗也證實了CsAP的降解能力。

綜上所述，本研究克隆、表達了華支睪吸蟲的酸性磷酸酶基因，并對其分子生物學特征、組織定位進行了分析，為進一步探討華支睪吸蟲膜抗原/分泌排泄抗原酸性磷酸酶的功能及診斷價值奠定了基礎。我們將通過體內、外實驗進一步證實其與華支睪吸蟲病肝纖維化之間的關系及其作用機制。

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