苦參堿對人前列腺癌PC-3M細胞周期與凋亡的影響

王桂秋

0 引言

前列腺癌是一種男性前列腺組織中的惡性腫瘤，其發病是前列腺腺泡細胞基因突變導致增殖不受控制的結果[1]。隨著病情的惡化，前列腺癌還會擴散到鄰近器官，甚至轉移到遠端部位，尤其是淋巴結和骨髓[2]。臨床上，該病的治療包括手術療法、化學療法、放射療法、激素療法單一治療或是幾種療法聯合應用[3]。而中藥治療癌癥具有其獨特的好處，包括低毒、多靶點、藥性溫和等[4]。苦參堿提取自豆科植物苦參(Sophora flavescens Ait)的根，具有利尿、抗病原體、抗肝炎、抗炎等作用，以及提高免疫力的藥理活性[5-6]。因此，在當前的實驗中，我們建立體外穩定的前列腺癌PC-3M細胞模型，以細胞凋亡為研究目標，進一步探討苦參堿的抗腫瘤作用與凋亡相關通路的內在聯系，為證明其對PC-3M促凋亡的作用機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人前列腺癌PC-3M細胞，購自上海腫瘤研究所。

1.1.2 藥物與試劑 苦參堿(純度>98%)：Spectrum公司。DMEM培養基：Invitrogen公司。小牛血清：Amersco公司。胰蛋白酶：Amersco公司。0.25%胰酶：Gibco公司。甲基偶氮唑鹽(MTT)：Sigma公司。二甲基亞砜(DMSO)：南京建成生物工程研究所。PI染色試劑盒：Roche公司。Cyclin D1蛋白抗體：南京建成生物工程研究所。DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司。p-ERK1/2抗體：Invitrogen公司。蛋白裂解液：南京建成生物工程研究所。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：Invitrogen公司。

1.1.3 儀器 Model 311 CO2培養箱(美國Thermo Forma公司)。IX71-A21PH倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。SZX型超凈工作臺(上海浦東躍欣科學儀器廠)。GelDoc XR+凝膠成像系統(美國Bio-rad公司)。JC303A-T電熱恒溫培養箱(成都一恒科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 無菌環境下，培養基RPMI-1640中加入新配置15% FBS、200 μg/mL青霉素、l50 μg/mL鏈霉素(4 ℃保存)。PC-3M細胞復蘇后，接種在培養瓶安置CO2培養箱中孵化(37 ℃，5% CO2)。D-Hank′s液沖洗3次，加入5 mL 0.25%的胰蛋白酶液，置37 ℃約10 min。終止消化后，細胞懸液移入無菌刻度離心管中，低速離心10 min后消化3次，進行細胞計數步驟。

1.2.2 分組及給藥 精密稱取苦參堿100 μg，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養基稀釋成不同濃度的MR終濃度(0、30、60、120 μM)，每孔100 μL，同時設5個平行孔/組，重復實驗5次，獲取平均值數據。應用Graphpad Prism軟件計算IC50(半數抑制率)，即MR治療PC-3M細胞24、48、72 h后的IC50值。同時增設對照組。細胞增殖抑制率=(OD對照-OD治療)/(OD對照-OD空白)×100%

1.3 指標檢測 MTT法檢測MR對PC-3M抑制率，PI染色檢測細胞形態學的變化，免疫組織化學法檢測細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表達，Western blot法檢測細胞外調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)磷酸化蛋白水平。

2 結果

2.1 MR給藥后對PC-3M細胞抑制作用 MTT法結果顯示，不同濃度MR抑制PC-3M的作用逐漸增強，與空白組比較差異有統計學意義(P<0.01)。此外，隨著時間的增加，MR的抑制作用不斷增強，提示MR治療有一定的時間-劑量依賴性。見圖1。

圖1 MR給藥對PC-3M細胞增殖的抑制作用

2.2 MR給藥后對PC-3M細胞組織形態學變化的作用 PI染色結果表明，空白組中PC-3M的細胞形態規則，輪廓清晰，核仁透亮，核漿比例正常。30 μM濃度MR給藥72 h后，PC-3M細胞體積縮小，細胞質空泡增多，核收聚，出現細胞凋亡。而經過60、120 μM濃度MR給藥，PC-3M細胞皺縮、脫落、密度降低，同時凋亡細胞計數增多。見圖2。

圖2 MR給藥后對PC-3M細胞形態的影響(PI染色，×100)

2.3 MR給藥后對PC-3M細胞Cyclin D1表達的影響 免疫組化結果顯示，空白組中PC-3M細胞Cyclin D1陽性細胞數量較多，處于激活狀態。經MR給藥后，PC-3M細胞Cyclin D1陽性細胞表達明顯減少，與空白組比較差異有統計學意義(P<0.01)。此外，結果顯示一定的時間-劑量依賴關系。見圖3。

圖3 MR給藥抑制PC-3M細胞Cyclin D1的表達(免疫組織化學染色，×100)

2.4 MR給藥后對PC-3M細胞Cyclin D1表達的影響 Western blotting結果顯示，空白組內源性p-ERK1/2水平上調，處于過表達狀態。經MR給藥后，PC-3M細胞增加的p-ERK1/2表達有效地下調，與空白組比較差異有統計學意義(P<0.01)。同時，實驗結果提示一定的時間-劑量依賴性。見圖4。

3 討論

前列腺癌是嚴重危害男性生命的惡性癌癥之一，當前主要采用放療、化療、手術、藥物治療等措施進行防治，但都普遍存在預后差和復發性[7]。而傳統中藥在前列腺癌的防治工作方面獲得了有效的進步[8]。在本實驗中，MTT結果表明，在生理狀態下PC-3M細胞增殖速度快，提示調控腫瘤細胞的過度增殖可以作為治療的方向。MR給藥后，能顯著抑制PC-3M增殖與分化，提示MR具有抑制腫瘤細胞增殖作用。此外，PI染色結果也說明，MR給藥能誘導PC-3M細胞發生形態變化，發生細胞凋亡現象。

圖4 MR給藥抑制PC-3M細胞p-ERK1/2的活性

Cyclin D1是細胞周期調節因子之一，不受控制的表達是原發性前列腺癌的特征，對臨床預后診斷具有重要意義[9]。腫瘤細胞中，Cyclin D1加速癌細胞周期素過度表達，同時造成CKIs細胞分裂的蛋白失活，從而加速腫瘤細胞的增殖、分化和生長[10]。免疫組化結果顯示，PC-3M細胞內源性Cyclin D1過度表達，說明Cyclin D1的異常表達促進了PC-3M細胞不斷增殖和分化。MR給藥后，能有效抑制PC-3M細胞Cyclin D1的表達，提示MR通過抑制PC-3M細胞Cyclin D1的活性而發揮抗腫瘤作用，結果與MTT實驗數據一致。

研究發現，細胞外調節蛋白激酶ERK1/2的生物學效應與細胞的增殖和分化密切相關，作用機制與其通過磷酸化反應可調節某些轉錄因子的活性，從而引起靶蛋白的活性變化，最終調節細胞代謝功能[11]。此外，ERK1/2的抗凋亡作用與激活磷酸化抗凋亡分子(如bac-2，Bad等)以及激活轉錄因子(如Cyclin D1等)有關[12]。因此，藥物干預作用在腫瘤細胞的ERKl/2靶點有助于抑制其發生發展。本實驗研究表明，PC-3M細胞內源性p-ERKl/2明顯上調。經MR給藥后，PC-3M細胞p-ERKl/2的表達被有效地下調，提示MR作用與PC-3M細胞ERKl/2靶點，抑制其生理活性，進而調節蛋白組件Cyclin D1的表達，進而誘導癌細胞發生細胞凋亡，故推測MR抗腫瘤作用與其抑制癌細胞內源性ERK1/2/Cyclin D1通路有關。

參考文獻：

[1] Yang B,Bhusari S,Kueck J,et al.Methylation profiling defines an extensive field defect in histologically normal prostate tissues associated with prostate cancer[J].Neoplasia,2013,15(4):399.

[2] Ryan CJ,Smith MR,de Bono JS,et al.Investigators.Abiraterone in metastatic prostate cancer without previous chemotherapy[J].N Engl J Med,2013,368(2):138.

[3] Tosoian JJ,Loeb S.Radical retropubic prostatectomy:comparison of the open and robotic approaches for treatment of prostate cancer[J].Rev Urol,2012,14(1-2):2.

[4] 何堅,胡建新,孫兆林,等.參芪結合雄激素阻斷治療前列腺癌[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(1):189.

[5] 劉麗敏,劉華鋼,毛俐,等.苦參堿和氧化苦參堿體外對腫瘤細胞增殖的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2008,14(11):35.

[6] 熊永愛,韓麗,王淼,等.氧化苦參堿干預IκB-α蛋白對潰瘍性結腸炎的治療作用機制研究[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(8):152.

[7] Darwish OM,Raj GV.Management of biochemical recurrence after primary localized therapy for prostate cancer[J].Front Oncol,2012,2(5):48.

[8] Parekh HS,Liu G,Wei MQ.A new dawn for the use of traditional Chinese medicine in cancer therapy[J].Mol Cancer,2009,8:21.

[9] Fu M,Wang C,Li Z,et al.Minireview:Cyclin D1:normal and abnormal functions[J].Endocrinology,2004,145(12):5439.

[10]Jirawatnotai S,Hu Y,Michowski W,et al.A function for cyclin D1 in DNA repair uncovered by protein interactome analyses in human cancers[J].Nature,2011,474(7350):230.

[11]Roskoski R Jr.ERK1/2 MAP kinases:structure,function,and regulation[J].Pharmacol Res,2012,66(2):105.

[12]Li DY,Tao L,Liu H,et al.Role of ERK1/2 in the anti-apoptotic and cardioprotective effects of nitric oxide after myocardial ischemia and reperfusion[J].Apoptosis,2006,11(6):923.