參芪扶正注射液對肝癌細胞株H22的抑制作用及機制研究

薛 瑞，曹軍華，李瑞生，李 燦

0 引言

腫瘤是目前危害人類健康和導致死亡的主要疾病?；熓悄[瘤三大常規治療手段之一，但化療藥物作用缺乏選擇性，在殺傷腫瘤細胞的同時，對機體也帶來損傷，特別是對免疫功能有很大的影響。參芪扶正注射液是國內首創的純中藥靜脈型大輸液，其主要成分為黨參、黃芪，具有益氣扶正的功效，為常用的抗腫瘤輔助藥，可減輕化療藥的毒副作用[1]。本研究觀察參芪扶正注射液體外對H22細胞增殖的抑制作用，體內對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響及對血清IFN-γ、TNF-α含量的影響，探討其抗腫瘤作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、材料與儀器 H22肝癌細胞由華中科技大學同濟醫學院提供；ICR小鼠，(20±2)g，雌雄兼用，由襄陽醫學院動物實驗中心提供，合格證號：襄醫動字第2001001號；參芪扶正注射液(麗珠集團利民制藥廠)；順鉑(江蘇豪森藥業股份有限公司)；5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；RPMI 1640培養粉(Gibco公司)；MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)；ELx800型酶聯免疫檢測儀(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；干擾素-γ酶聯免疫試劑盒(北京艾然生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子-α定量酶聯檢測試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)；其他試劑均為國產分析純。

1.2 MTT法測細胞抑制率 H22細胞置于5%CO2、37℃培養箱中，用含100 mL/L小牛血清DMEM培養液培養，每24 h更換1次培養液，隔天傳代1次，取傳代后2 d處于對數生長期的細胞以1×105/mL密度接種于96孔培養板中，培養24 h后，分別加入順鉑(終濃度分別為10、20、40 μg/mL)，參芪扶正注射液(終濃度分別為5、10、20、40、80、160 μg/mL)，每組6個復孔，另設正常對照組。分別于48、72、96 h 3個時相各取一塊96孔板進行MTT比色實驗：每次于實驗結束前加入MTT，繼續培養4 h后，按常規采用酶標儀(波長570 nm)測各孔吸光度值(A)。按公式“(1-藥物孔A值/對照孔A值) ×100%”計算細胞抑制率，以劑量和生長抑制率作直線相關分析。

1.3 模型小鼠的建立、分組及給藥 ICR小鼠，除正常對照組外，每鼠接種0.2 mL H22細胞懸液于右腋窩皮下。24 h后，隨機分為荷瘤對照組、陽性對照組及參芪扶正3個劑量組，每組10只。正常對照和荷瘤對照組灌胃生理鹽水0.2 mL/d；陽性對照組腹腔注射5-Fu 25 mg/(kg·d);參芪扶正3個給藥組分別按照25、50、100 mg/(kg·d)灌胃給藥，皆給藥10 d。

1.4 抑瘤率的檢測 取血后，頸椎脫臼處死小鼠，立即完整剝離瘤塊，稱量瘤塊重量，計算各組平均瘤塊重量及抑瘤率，抑瘤率(%) =[1-(給藥組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)]×100%。

1.5 血清IFN-γ含量的檢測 停藥次日摘除眼球法取血，常規分離血清，按照小鼠酶聯免疫(ELISA)IFN-γ試劑盒使用說明操作，測定小鼠血清中IFN-γ的含量。

1.6 血清TNF-α含量的檢測 停藥次日小鼠摘眼球取血，分離血清，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定血清TNF-α含量，參考說明書步驟操作，于492 nm處檢測吸光度值(A492 nm)，根據濃度標準曲線計算TNF-α含量。

2 結果

2.1 對H22細胞生長的抑制作用 顯微鏡下觀察，參芪扶正注射液作用后的H22細胞排列稀疏，隨作用時間延長和藥物濃度的增加細胞密度逐漸減少。MTT實驗結果顯示，各劑量組參芪扶正均可抑制H22細胞的增殖，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制率增加，參芪扶正對H22細胞的抑制作用具有統計學意義。結果見圖1。

圖1 參芪扶正對H22細胞增殖的抑制作用

2.2 對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用 實驗結果顯示，5-Fu和參芪扶正三個劑量組瘤塊重量均明顯低于荷瘤對照組(P<0.01，P<0.001)，參芪扶正高、中、低三個劑量的抑瘤率分別為47.43%、32.43%和21.42%，呈現劑量依賴性，提示參芪扶正注射液對H22荷瘤小鼠腫瘤的生長具有明顯的抑制作用，結果見表1。

表1 參芪扶正注射液對荷H22小鼠的抑制作用

注：與陰性對照組比較，*P<0.01；**P<0.001

2.3 對荷瘤小鼠血清IFN-γ含量的影響 H22荷瘤小鼠IFN-γ含量明顯受到抑制，與空白組比較差異有統計學意義(P<0.01)；5-Fu抑制荷瘤小鼠血清IFN-γ的形成，與荷瘤對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；參芪扶正三個劑量組均可提高荷瘤小鼠血清IFN-γ含量，與荷瘤對照組比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，見表2。

2.4 對荷瘤小鼠血清TNF-α含量的影響 荷瘤對照組小鼠的TNF-α含量明顯低于空白對照組(P<0.01)；5-Fu能夠提高荷瘤小鼠的TNF-α含量，與荷瘤對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；參芪扶正中、高劑量可提高荷瘤小鼠的血清TNF-α含量，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 參芪扶正注射液對荷瘤小鼠IFN-γ的影響

注：與空白對照組比較，△P<0.01；與荷瘤對照組比較，*P<0.05；**P<0.01

表3 參芪扶正對荷瘤小鼠血清TNF-α 含量的影響

注：與空白對照組比較，△P<0.01；與荷瘤對照組比較，*P<0.05

3 討論

體質內虛是腫瘤發生的主要病因，正氣虧損，正邪斗爭始終存在于腫瘤的發生、發展過程中[2]。腫瘤因正氣虛而得病，因虛而致實，故在惡性腫瘤治療方面，祛邪雖不可輕視，但益氣扶正占有更加舉足輕重的地位。中藥制劑參芪扶正注射液是采用黃芪、黨參等中藥為主要原料，根據傳統中醫理論，運用現代制藥工藝研制而成，具有扶正固本、益氣補虛、活血化瘀的功效[3-6]。從中醫理論上參芪扶正注射液應具有良好的抗腫瘤作用。MTT實驗結果顯示，參芪扶正注射液體外可抑制H22細胞的增殖，且抑制率具有濃度和時間依賴性；體內實驗觀察到參芪扶正注射液可明顯抑制荷H22小鼠腫瘤的生長。

IFN-γ是一種糖蛋白，具有較強的免疫調節功能，能增強細胞功能，加快免疫復合物清除和提高吞噬異物功能，對淋巴細胞具有雙向調節作用[7-8]。TNF-α主要由單核-巨噬細胞產生，可以直接殺傷腫瘤細胞，也可通過抑制腫瘤血管生成等間接途徑殺傷腫瘤細胞，還可誘導許多不同來源腫瘤細胞凋亡[9]，是迄今為止所發現的抗腫瘤作用最強的生物活性因子之一?，F在，IFN-γ和TNF-α在腫瘤的免疫調控監視及腫瘤發生與發展中的作用越來越受到重視[10]。

本研究結果顯示，荷瘤對照組小鼠血清IFN-γ和TNF-α含量都明顯受到抑制，說明小鼠荷瘤以后其免疫功能受到抑制。參芪扶正注射液3個給藥組皆可顯著促進荷瘤小鼠血清中IFN-γ和TNF-α的表達，這為參芪扶正注射液通過增強荷瘤機體免疫功能而發揮抗腫瘤作用提供了免疫分子學依據。參芪扶正注射液抗腫瘤作用還有其他機制，有待進一步研究。

參考文獻：

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