LC-MS法測定大鼠血漿中EXH-1626的濃度及其藥代動力學研究

李泰平，肖 紅，向 華

0 引言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來，乳腺癌發病正日漸年輕化，已嚴重影響婦女的身心健康及生命安全，因此，研制有效安全、毒副作用小的新型抗乳腺癌藥物顯得尤為迫切。EXH-1626是中國藥科大學藥物化學教研室合成的一種新型6-芳基茚并異喹啉酮衍生物，藥效學研究表明其可以用于治療乳腺癌，其分子式為C29H28N2O3。茚并異喹啉酮類化合物是美國國立癌癥研究中心(NCI)通過COMPARE系統比較篩選而得到的一類新型拓撲異構酶Ⅰ抑制劑，與喜樹堿類化合物相比，茚并異喹啉酮類化合物沒有內酯環，因而在體內表現出更好的化學穩定性[1]。關于EXH-1626在生物樣品中的測定方法的文獻報道較少[2]，本試驗旨在建立一種測定速度快、準確度高、可操作性強的液相色譜-質譜法，并應用于EXH-1626的大鼠體內藥代動力學研究，為其非臨床藥代動力學研究提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑 EXH-1626鹽酸鹽標準品(由中國藥科大學藥物化學教研室提供，批號：20100927，純度99.2%)；卡馬西平(中國藥品生物制品檢定所，0142-9503)；純凈水(杭州娃哈哈純凈水公司)；甲醇、乙腈(色譜純，TEDIA公司)；蛋白沉淀劑(甲醇∶5%硫酸鋅=70∶30，V/V)；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器 Agilent 6410型三重四級桿質譜聯用儀與1200型液相色譜系統，均為美國Agilent公司產品，包括ESI離子化源，MassHunter B.03.01(數據采集與定性)和MassHunter B.04.00(數據分析)處理軟件，Binary SL四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器以及柱控溫箱。

2 方法

2.1 實驗條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為ODS C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，漢邦公司；流動相為乙腈-10 mmol/L醋酸銨水溶液(乙酸調pH至3)(70∶30)；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

2.1.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源(ESI)；SIM檢測方式；干燥氣溫度為350 ℃；干燥氣流速為10 L/min；毛細管電壓4 000 V；霧化器壓力為40 psi；定量分析的離子[M+H]+分別為m/z 453.3(EXH-1626)，碰撞能160 V；m/z 237.1(內標)，碰撞能130 V；掃描時間為20 ms。

2.2 標準溶液的配制

2.2.1 EXH-1626標準溶液的配制 精密稱取EXH-1626標準品25.0 mg，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，得1.0 mg/mL貯備液，然后依次加水稀釋配成100 000、50 000、10 000、5 000、1 000、500、200、100和50 ng/mL EXH-1626標準溶液，4 ℃保存備用。

2.2.2 卡馬西平內標溶液的配制 精密稱取5.8 mg卡馬西平于100 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度，即配制成58 mg/mL卡馬西平儲備液。取一定量的卡馬西平儲備液，用流動相稀釋至100 μg/mL作為內標溶液，4 ℃保存備用。

2.2.3 標準血樣的制備 取離心管數支，分別精密加入不同量的EXH-1626標準液后以氮氣流吹干，加入空白血漿200 μL，渦旋1 min，配成血漿中含EXH-1626分別為5、10、20、50、100、500、1 000、5 000和10 000 ng/mL的標準系列濃度，同法依次配成血漿中含EXH-1626分別為10、100、1 000和10 000 ng/mL的由低到高濃度的質量控制(QC)血樣。

2.3 血漿樣品的處理 精密量取血漿樣品200 μL于空白離心管中，精密加入10 μL內標溶液(100 μg/mL)，渦旋混勻后再精密加入蛋白沉淀劑200 μL，渦旋1 min，混勻后離心(12 000 r/min) 10 min，吸取上清液至分析小瓶中，進樣5 μL分析。

2.4 藥代動力學 Sprague-Dawley大鼠16只，清潔級，體重(200±20) g，由南京醫科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(蘇)2008-0004。隨機分4組，每組4只，雌雄各半。實驗前禁食12 h，自由飲水。口服實驗，取兩組大鼠稱重后按80和250 mg/kg的劑量灌胃給予EXH-1626混懸溶液(用純凈水配制)，于給藥前以及給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144和168 h，由大鼠斷尾采血0.4 mL。靜脈實驗，另取兩組大鼠按10和20 mg/kg劑量尾靜脈注射給予EXH-1626葡萄糖溶液(用5%葡萄糖溶液配制并滅菌處理)，于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48和72 h，由大鼠斷尾取血0.4 mL左右。血樣均置于預先肝素化的試管中，經12 000 r/min離心10 min后分離血漿，-20 ℃保存待測。所得的血藥濃度時間數據應用中國藥科大學生物利用度研究數據處理通用程序BAPP2.2軟件計算EXH-1626的藥代動力學參數。

3 結果

3.1 方法的專屬性 在本實驗所采用的條件下，EXH-1626和內標的保留時間分別為2.9和3.5 min左右。如圖1所示，EXH-1626和內標峰形良好，能有效分離，無雜峰干擾測定，專屬性良好，血漿中內源性物質不干擾EXH-1626和內標的測定。EXH-1626及內標的一級掃描質譜圖，見圖2。

圖1 空白血漿、EXH-1626及卡馬西平的典型色譜圖

圖2 EXH-1626(A)及內標(B)的一級掃描質譜圖

3.2 線性范圍和定量限 按“2.2.3”項下操作配制系列血藥濃度為5、10、20、50、100、500、1 000、5 000和10 000 ng/mL的樣品，按“2.3”項下操作，進樣分析，建立EXH-1626的標準曲線。EXH-1626濃度(ng/mL)為縱坐標，以y表示，EXH-1626峰面積(As)與內標峰面積(Ai)的比值(As/Ai)為橫坐標，以x表示，線性回歸計算得回歸方程為y=101.13x-34.55(r=0.999 7，權重系數為1/c2)，EXH-1626血漿濃度在5～10 000 ng/mL范圍內線性關系良好，定量下限濃度為5 ng/mL(S/N>10)。

3.3 精密度實驗 以空白血漿配制由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4個不同濃度的EXH-1626 QC樣品，每一濃度進行5份樣本分析，連續測定3 d，并與標準曲線同時進行，根據當日的標準曲線計算QC樣品的濃度，將QC樣品的結果進行分析，結果顯示，由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4個不同濃度的日內、日間精密度分別為8.7%、4.4%、4.3%、1.1%和7.4%、4.1%、4.0%、1.4%，符合生物樣品分析方法的要求。

3.4 回收率實驗 以空白血漿配制由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4個不同質量濃度的EXH-1626 QC樣品，每一濃度各5份樣本，按“2.3”項下操作，計算并記錄EXH-1626與內標峰面積之比(a)，由相應的標準曲線計算濃度，該濃度與加入的濃度之比為相對回收率。同時以流動相代替空白血漿，同法計算提取回收率。結果顯示，由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4個濃度的相對回收率和絕對回收率分別為108.1%、106.5%、103.6%、99.7%和72.5%、76.3%、78.4%、76.6%，符合生物樣品分析要求。

3.5 穩定性實驗 取離心管數支，制備由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4個不同濃度的血漿樣本各5份，1份制備好后按“2.3”項下操作，立即進樣分析；1份室溫下放置6 h；1份血樣冰箱中(4 ℃)放置12 h后同法操作；1份于冰箱中(-20 ℃)冷凍保存15 d后取出化凍；1份在1個月內反復凍融3次，然后同法操作。結果各濃度樣本測定值的偏差均小于10%，結果表明，樣品在上述條件下穩定性良好。

3.6 藥代動力學研究結果 大鼠以80 mg/kg劑量口服EXH-1626后0.5 h，在血中均可測到其濃度，藥時曲線有雙峰現象，給藥后3和6 h達到濃度峰值。實驗數據經BAPP軟件分別以單室和雙室模型處理，計算主要藥代動力學參數，比較AIC、r2、Re三個值，以r2值最大確定其為單室模型(權重系數為1)。而以250 mg/kg劑量口服給藥后于2、8、48和120 h重復達到濃度峰值，見圖3，實驗數據經BAPP軟件不能很好擬合處理，兩組主要藥代動力學參數見表1。

圖3 大鼠口服給藥藥時曲線

表1 大鼠口服給藥后藥代動力學參數(權重系數為

大鼠尾靜脈注射后，分布很快，見圖4。其主要藥代動力學參數見表2。實驗數據分別以單室和雙室模型處理，比較AIC、r2、Re三個值，以r2值最大確定其為單室模型(權重系數為1)。

圖4 大鼠靜脈注射給藥后的藥時曲線

大鼠口服給藥的絕對生物利用度采用公式計算：

其中AUCi.v.和AUCt分別為尾靜脈注射和口服條件下的AUC、Xiv和Xt分別為尾靜脈注射和口服的藥物劑量。由上述數據經計算可得，口服給予80和250 mg/kg劑量下絕對生物利用度分別為14.14%和21.74%。

表2 大鼠靜脈給藥后的主要藥動學參數(權重系數為

4 討論

4.1 流動相及內標的選擇 在流動相選擇方面，筆者研究比較了甲醇、乙腈、醋酸和三乙胺水溶液的不同濃度、有機相與水相的不同構成比及流動相的不同pH值對分析結果的影響，最后選擇乙腈-0.01 mol/L醋酸銨水溶液(用乙酸調pH至3)(70∶30)為流動相，在此條件下，EXH-1626和內標的保留時間分別為2.9和3.5 min，目標化合物峰形良好。

內標的選擇既要考慮質譜的響應與待測物的匹配性，又要兼顧其不與EXH-1626藥物及蛋白沉淀劑發生反應。實驗中曾篩選了多個化合物，如甲硝唑、地西泮等，發現在本實驗條件下，由于保留時間較長或者干擾目標峰而放棄，選用卡馬西平為內標，它不僅穩定性好，對待測物和沉淀劑穩定，與色譜柱親和力適中，保留時間合適。

4.2 血漿樣品的前處理 本文采用蛋白沉淀法進行血樣處理，所應用的蛋白沉淀劑由甲醇和5%硫酸鋅溶液(體積比為70∶30)組成，用此蛋白沉淀劑直接沉淀血漿中的蛋白，不僅蛋白沉淀較完全，而且與主藥及內標不發生反應，稀釋體積也小(1∶1，V/V)。沉淀離心蛋白后直接取上清液進樣分析，此法操作簡便、快速，為EXH-1626濃度的測定提供了簡便、可靠的方法。

4.3 EXH-1626在大鼠體內的藥代動力學特征 大鼠口服給予250 mg/kg EXH-1626后，藥時曲線呈現多峰現象，并且消除緩慢，明顯不遵循一級動力學規律，t1/2也隨給藥劑量增加而延長，血藥濃度和AUC與給藥劑量明顯不成正比，呈現非線性動力學過程，其在大鼠體內處置過程存在飽和效應。尾靜脈注射10和20 mg/kg 2個劑量后，用AUC0-∞分別除以相應的劑量，所得比值分別為526.10和764.48，所得比值明顯不同，t1/2隨著劑量的增加而延長，CL也明顯地隨劑量大小而改變。因此，EXH-1626在大鼠體內具有非線性藥代動力學特征。在80 mg/kg口服試驗組中，每個動物藥時曲線均出現雙峰現象，尤其給予250 mg/kg劑量后，在時間靠后的取血點血藥濃度出現反復升高，這給藥動學參數的計算帶來很大困難。近年來已發現相當多的藥物單次給藥后，血藥濃度時間曲線出現雙峰現象[3-6]，引起雙峰或多峰現象的常見原因可能有：肝腸循環[3,7]、多部位吸收[4]、胃腸循環[8]和蛋白競爭等等，其中肝腸循環是該研究中產生多峰現象最可能的原因，這還有待進一步研究。

總之，本實驗采用LC-MS法測定大鼠血漿中EXH-1626的濃度，該方法快速、準確、靈敏度高，適用于EXH-1626血藥濃度的測定及其非臨床藥代動力學研究，為其新藥研發奠定了基礎。

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