長江口及鄰近海域鮸魚的遺傳多樣性分析

郭垚示 ，孫鑫序 ，張玉榮 ，樓寶 ，詹煒 ，毛國民 ，陳睿毅

（1.浙江海洋學院，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山 316000）

鮸魚（Miichthysmiiuy）屬鱸形目、石首魚科、鮸魚屬，是一種暖溫性底層魚類，自然分布于我國及朝鮮沿海（莊平等，2006）。它肉質鮮美、營養豐富，系沿海常見的食用經濟魚類。長江口是我國漁業種質資源的寶庫，水產種質資源豐富，棲息著多種名貴經濟魚類；同時也是我國著名的漁場之一，具有豐富的漁業資源。近年來，由于過度捕撈、環境污染等人類活動的干擾，長江口漁業資源急劇衰退，包括鮸魚在內的主要經濟魚類的資源量顯著下降（李美玲等，2009）。因此，開展長江口及鄰近海域鮸魚的種質資源及遺傳多樣性現狀的研究，對長江口重要漁業種質資源的保護和合理開發利用具有極其重要的意義。

海洋物種的遺傳多樣性研究不僅對種質資源的保護和合理開發利用具有重要意義，同時，還能為漁業資源的管理和監測提供參考（Shui et al，2009）。因此，海洋物種的遺傳多樣性研究一直受到學者們的高度重視。現代分子生物測序技術的發展，基于基因序列測定的分子數據已經廣泛應用于魚類種群遺傳分析的各個方面（董麗娜等，2011）。線粒體DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）具有結構簡單、母性遺傳、進化速度快、核苷酸替代率高等特點，已成為魚類進化生物學和群體遺傳學研究的有效工具（劉云國等，2009）。在線粒體基因組中，細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome coxidase subunitⅠ，COⅠ）序列進化速度較快且容易擴增，因此廣泛應用于種群水平遺傳多樣性的檢測（孫鵬等，2011）。

目前對鮸魚的研究報道多集中于發育生物學和人工繁殖技術等方面（鐘俊生等，2005；孫慶海等，2003；李明云等，2005；樓寶，2005），關于鮸魚種群結構及遺傳多樣性的研究相對較少。國內學者彭志蘭等（2010）利用AFLP分析了舟山近海野生親魚和人工繁育子一代的群體遺傳多樣性；Cheng等（2011）利用線粒體控制區分析了浙江海域6個鮸魚群體的遺傳多樣性現狀；夏月恒等（2013）利用Cytb初步分析了我國近海38尾鮸魚的遺傳多樣性。長江口及鄰近海域是鮸魚重要的產卵場和棲息地，本研究利用COⅠ基因序列片段對長江口及鄰近海域鮸魚群體遺傳變異進行分析，以期為長江口及鄰近海域鮸魚資源的合理開發利用提供科學的參考依據，并為將來其遺傳育種與良種選育提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

實驗用鮸魚樣品共60尾，于2011年分別采集自崇明 （31°81′N， 121°65′E，數量 30 尾，全長為 23.62～28.78 cm，體重為 157～262 g）和舟山（30°08′N，122°30′E， 數量 30 尾，全長為 19.72～25.78 cm，體重為107～232 g）沿海 （圖1），經過形態學鑒定后取其尾鰭保存于95%乙醇中，運回實驗室后保存，用于基因組DNA的提取。

圖1 鮸魚樣本采集分布圖

1.2 DNA的提取、PCR擴增及測序

基因組DNA采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取（TIANGEN，北京）。COⅠ序列的擴增參照Sun等（2012）的方法進行，稍加修改。擴增引物COⅠ-F（5’-TCA ACCAACCACAAA GAC ATT GGC AC-3’）和 COⅠ-R （5’-TAG ACT TCTGGG TGG CCA AAG AATCA-3’），由上海生工生物技術有限公司合成。PCR反應體系為50μL，其中包含模板 DNA 400 ng，10×PCR buffer 5μL，25mmoLMg2+4μL，2.5mmoL dNTPs 4μL，Taq DNA聚合酶 （Takara）1U，10mM的上、下游引物各2μL；反應程序為：94℃預變性2min，94℃變性45 s，52℃退火1min，72℃延伸1min，共進行35個循環，最后72℃再延伸7min。PCR擴增產物通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠純化試劑盒回收（TIANGEN，北京）PCR產物，純化后測序。

1.3 數據分析

采用 BioEdit7.0（Halletal， 2009）對DNA 序列進行編輯和人工核查；利用Clustal X 1.83（Thompson etal，1997）軟件進行同源序列比對；DNA序列的堿基組成、多態位點數（S）、單倍型數（N）、核苷酸多樣性（Pi）和單倍型多樣性（Hd）等遺傳多樣性參數用MEGA 4.0（Tamura et al， 2007）和 DNASP 5.0 （Rozas etal， 2003）軟件進行計算分析；在Arlequin3.1（Exoffier et al，2008）軟件中進行AMOVA分析，計算群體間遺傳分化系數（F-statistics，FST），檢驗其顯著性水平（重復次數1 000），由公式Nm=（1-FST）/2 FST計算群體間的基因流Nm。通過中性檢驗分析鮸魚的群體歷史動態，采用Arlequin軟件計算Tajima’D，Fu and Li’F，Fu and Li’D，以及 Fu’s Fs統計檢驗值，以檢驗群體是否顯著偏離中性進化（Rozaset al， 2003； Exoffier etal， 2008）。

2 結果

2.1 線粒體COⅠ基因片段的序列分析結果

將所測得序列在GenBank中進行Blast比對，確定為鮸魚線粒體的COⅠ基因部分序列。序列經比對分析后剪輯對齊，得到長度為599 bp的COⅠ基因片段。在所測的60條序列中，A、T、G、C堿基的平均含量分別為22.9%、26.9%、20.0%和30.2%。A+T的含量為49.8%，G+C的含量為50.2%，G+C的含量略高于A+T的含量（表1）。在密碼子第一位，G和C的含量為53%；在密碼子第2位，T的含量最高，為41%；而在密碼子第3位，C含量最高，占總堿基數的46.7%，而G含量最低，只有10.6%。

表1 鮸魚兩個群體COⅠ基因片段堿基組成

2.2 單倍型分布及群體的多樣性指數

對2個群體共60尾鮸魚的COⅠ基因序列進行分析，共定義20種單倍型，存在22個多態性位點，產生23個突變。在所有的多態性位點中，簡約信息位點（I）有7個，占總位點數的1.2%；單一位點15個，占總位點數的2.5%；平均轉換與顛換比（Ti/Tv）為3.61，沒有發現插入或缺失現象（表2）。Hap3、Hap11和Hap19為共享單倍型，分別包括3個、4個和34個個體，其余17個單倍型為單一群體獨享。兩群體的平均單倍型多樣性（Hd）為0.676 8，核苷酸多樣性（Pi）為 0.002 29，平均堿基差異（K）為1.374。各個群體的遺傳多樣性見表2，其中舟山群體的遺傳多樣性指數（Hd=0.749 4±0.08 4，Pi=0.002 38±0.000 51）均略高于崇明群體（Hd=0.602±0.104，Pi=0.002 18±0.000 52）。

表2 鮸魚兩個群體遺傳多樣性參數

表3 鮸魚群體分子方差分析結果

2.3 群體遺傳結構和歷史動態數據分析

利用Arlequin3.1軟件估算2個群體間的分化指數（FST）和基因交流值（Nm），結果表明崇明和舟山群體間有較高的基因交流值（Nm≈56），無明顯的遺傳分化 （FST=0.008 83，P＞0.05）（表3）。采用鄰接法（NJ）構建的20個單倍型的分子系統樹如圖2所示。所有的單倍型被分成兩個分支。NJ樹的上側分支中，14個單倍型聚為一支，其余6個單倍型構成另一支。中性檢驗Tajima′s D和Fu′s Fs結果如表4所示，2個群體的檢驗值均為負值且差異顯著（P＜0.05），顯示兩群體經歷群體擴張事件。

圖2 基于鮸魚COⅠ基因序列構建的NJ系統樹

表4 鮸魚群體的中性檢驗分析

3 討論

3.1 單倍型及群體遺傳多樣性

本研究中，鮸魚2個群體60個樣本中，共檢出22個多態性位點，定義了20個單倍型，其中Hap3、Hap11和Hap19為2個群體所共有，其中具有Hap19的個體數為34個，占總數的56.7%。推測Hap19很可能是較原始的單倍型類型，其他單倍型可能由此單倍型演變而來（圖3）。長江口兩個鮸魚群體的平均單倍型多樣性指數為0.677，平均核苷酸多樣性為0.002 29，呈現出較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性水平。本研究的鮸魚遺傳多樣性參數比Cheng等（2011）利用線粒體控制區分析的浙江海域6個鮸魚群體的遺傳多樣性指數低（Hd=0.9933，Pi=0.0097）低，較之夏月恒等（2013）利用Cytb對黃海和東海的38尾鮸魚遺傳多樣性的分析結果（Hd=0.960±0.020，Pi=0.002 71±0.000 30）也要低。分析其原因，可能是線粒體基因組不同編碼區域的遺傳變異速率不同有關，線粒體的COⅠ基因序列的變異速率要比Cytb和控制區的變異速率低引起的（Sbisàetal，1997）。

圖3 鮸魚單倍型中介連接網絡關系圖（崇明（白），舟山（黑））

Grant等（1998）根據群體的單倍型多樣性指數（Hd）和核苷酸多樣性指數（Pi）將海水魚類大致分為4種類型：第一種類型是低的單倍型多樣性與低的核苷酸多樣性 （Hd＜0.5，Pi＜0.005）；第二種類型是高的單倍型多樣性與低的核苷酸多樣性；第三種類型是低的單倍型多樣性與高的核苷酸多樣性；第四種類型是高的單倍型多樣性與高的核苷酸多樣性。鮸魚具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，應屬第二種類型。這種遺傳多樣性模式在其他海水魚類中如大瀧六線魚、銀鯧、花鱸和松江鱸等也廣泛存在（Habib et al，2011；彭士明 等，2009；Liu et al，2006；高天翔等，2013）。該類型表明鮸魚種群可能處于瓶頸效應后的增長與突變積累時期，即鮸魚可能是由一個小的種群經過擴張形成，快速的種群增長有利于單倍型多樣性的增加，但沒有足夠的時間積累核苷酸的變異，因此導致了單倍型多樣性指數較高而核苷酸多樣性指數較低的遺傳多樣性模式（Bowen et al，2001）。中性檢驗結果表明所研究的鮸魚群體經歷過選擇和顯著擴張。單倍型中介連接網絡關系圖大致呈星狀放射結構（圖3），也提示種群所經歷的擴張歷史 （Cheng et al， 2011；Liu et al，2006）。

3.2 群體遺傳分化和基因流

一般而言，海洋魚類由于具有較大有效群體數量和遷移擴散能力而存在廣泛的基因流和較低的遺傳分化水平（Beheregaray etal，2001）。遺傳分化系數FST是用來測量群體之間遺傳分化的重要指標，在0到1的范圍內，FST值越大，兩種群的分化程度越高（楊金權等，2008）。本研究中，分子方差分析（AMOVA）結果表明，遺傳變異主要來自群體內（99.12%），而群體間較小的遺傳分化系數較小（FST=0.008 83，P＞0.05），表明這兩個群體間無顯著遺傳分化。本研究結果與Cheng等（2011）和夏月恒等（2013）的研究結果基本一致。夏月恒等通過Cytb發現我國近海3個地點的鮸魚群體未出現明顯遺傳分化，Cheng等分析浙江海域6個地理群體遺傳結構發現僅存在微弱的遺傳分化。基因流系數Nm反映種群之間的交流情況，當Nm＜1時，種群之間處于隔離狀態；Nm＞1時，表明種群間存在一定的基因流動；當Nm＞4時，表明各群體為一個大的隨機單元（Masatoshietal，2000）。本次研究得到的基因流系數Nm≈56，表明舟山跟崇明群體為一個大的隨機單元。用鄰接法構建的系統樹和利用Network構建的網絡圖均顯示不同地理來源的單倍型交錯分布，沒有明顯的地理群聚和譜系結構。究其原因，一方面可能是由于舟山和崇明兩個群體的地理間隔較小；另一方面由于長江口是鮸魚重要產卵區，其生殖期由深水向近岸作洄游形成隨機交配的群體；從而導致兩個群體間具有廣泛的基因交流，遺傳同質性程度較高（莊平等，2006）。

群體遺傳結構研究是進行某一群體長期的可持續保護和管理的重要組成部分，物種遺傳多樣性的高低與其適應能力、生存能力和進化潛力密切相關，遺傳變異是有機體適應環境變化的必要條件（Yang etal，2007）。本研究發現兩個群體遺傳多樣性水平相對較低，推測其可能是由于捕撈壓力和環境惡化導致鮸魚補充群體逐年減少、資源量下降，進而引起有效群體的數量、大小迅速下降，出現瓶頸效應，從而最終導致了群體遺傳多樣性水平的下降。同時，由于本研究僅采用了COⅠ分子標記以及分析的種群數量有限，可能未全面反映鮸魚的遺傳結構，因此下一步研究需要結合多個分子標記手段并增加采樣范圍，以期對鮸魚遺傳多樣性水平、種群歷史進行更深入的分析，從而更加準確評估其有效種群大小，制定和采取合理的保護和管理措施。

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