基于mtDNA ND1基因序列研究不同地理群體波紋唇魚的遺傳多樣性和遺傳分化

胡靜， 侯新遠，尹紹武， 祝斐， 賈一何， 胡亞麗

（1.南京師范大學 生命科學學院，江蘇 南京 210023；2.海南大學 海洋學院，海南 ?？?570228）

波紋唇魚（Cheilinus undulatus），在分類學上隸屬鱸形目（Perciformes）、隆頭魚科（Labridae）、唇魚屬（Cheilinus），是一種暖水性魚類，同時也是體型最大的珊瑚礁魚類之一。分布于非洲東岸、紅海以及印度洋至太平洋中心，在我國主要分布于南海與東海的南部海域（沈世杰，1993；Donaldson etal，2001）。波紋唇魚為名貴的海水經濟魚類，其肉質細嫩味鮮，營養價值高，深受亞洲人喜愛。因過度捕撈及珊瑚礁棲息地破壞等因素，導致自然海區的波紋唇魚數量越來越少，目前已瀕臨滅絕。1996-2005年間波紋唇魚曾四度被世界自然保護聯盟（IUCN）、世界自然基金會（WWF）等組織和《瀕危野生動植物種國際貿易公約》（CITES）列入瀕危物種名單。因此，有關波紋唇魚的遺傳資源調查、資源保護等工作亟待加強。

有關波紋唇魚繁殖研究，印度尼西亞和我國均對波紋唇魚進行過人工誘導產卵試驗，仔魚培育均未獲成功，該魚規模化繁育難題仍然沒有突破，仍舊采用的是野種家養的方式 （Murdjani et al，1996；頡曉勇等，2001）。

國內有關波紋唇魚的研究在形態學、組織學以及食用中毒及毒后救護方面有少許報道，對其同工酶、染色體核型分析以及線粒體全序列也進行了相關報道（霍蕊，2009；區又君等，2009）。

國外對波紋唇魚的基礎生物學等方面報道較多（Donaldson et al，2001；Sadovy et al，2003）。但是，目前少見關于波紋唇魚分子遺傳學方面的報道（胡靜等，2012；彭艷輝等，2012），尤其是有關其種質資源和遺傳多樣性的研究。近年來，隨著mtDNA研究的不斷深入，因為其具有分子量小、結構簡單、演化速度快、母系遺傳等優點而成為有效的分子標記廣泛應用于物種系統進化研究（郭新紅 等，2004； 朱葉 等，2012； 沈玉幫 等，2011；徐敬明，2010）。由于mtDNA ND1基因序列的保守性，一般很少用來作為同種生物多樣性的研究，而多用在種間遺傳分析水平上（Carr etal，1991；Chapman，1994），但也有少數關于ND1基因結合其他基因來研究種內和群體系統發育關系的研究報道（邵愛華等，2007；周春花等，2007）。

本研究對分布于海南陵水、馬來西亞、西沙以及南沙4個不同地理群體波紋唇魚共101尾個體的ND1基因序列進行擴增、克隆及測序，旨在研究波紋唇魚群體的ND1基因序列變異情況，分析其序列多態性、遺傳多樣性以及群體的遺傳關系，以獲得相關數據，為該物種種群遺傳多樣性和保護生物學的研究提供科學資料。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

野生群體波紋唇魚共101尾，分別為海南陵水（LC）、馬來西亞 （MC）、西沙 （XC）以及南沙（NC）4個不同地理群體（圖1），各31、20、14、36尾，經過形態學鑒定（沈世杰，1993），對101尾個體編號，取樣品尾鰭組織于95%乙醇中保存備用。

圖1 波紋唇魚的取材位置

1.2 DNA的提取、擴增、克隆及測序

分別取0.1 g尾鰭組織來提取基因組DNA。基因組DNA的提取按常規的“酚–氯仿”方法進行（薩姆布魯克，1995），DNA經冰乙醇沉淀、70%乙醇洗滌并干燥后，用50μLTE溶解，-20℃保存備用。

從Genbank中導出波紋唇魚的mtDNA全序列（序列號：GU296101），使用Primer primer 5.0軟件設計用于擴增ND1基因的1對引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。正向引物為F1（5'CGTTAATGTGGCAGAGCT 3'），反向引物為R1（5'CTAAAAGGAGATGGAGGG 3'）。

每個PCR反應總體積均為25μL，其中包括2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL Mg2+（25 mmol/L），2μL dNTP（2 mmol/L），正反向引物各 1μL（10 μmol/L），0.3μLTaq DNA polymerase（5U/μL），14.2μL ddH2O，模板 2μL。PCR反應程序為：94℃預變性4min，然后進行30個熱循環（94℃、30 s，51℃、30 s，72℃、2 min），72℃延伸10min；10℃保溫。

擴增產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的條帶切下并用DNA純化試劑盒回收，目的片段與pMDTM18-TVector*1（寶生物工程有限公司）連接。連接產物與DH5ɑ感受態細胞充分混勻轉化。挑取目的單克隆菌落于含有氨芐的液體培養基中擴大培養，克隆后對其菌液進行雙向測序，由上海華大基因公司測序。

1.3 數據處理

雙向測序結果在BLAST上進行比對分析后，人工拼接成完整序列；在ClustalX軟件上對比、參照波紋唇魚mtDNA全序列（序列號：GU296101）中對應的基因剪切測序所得序列，對比后的序列在MEGA 5.0軟件 （Tamura，2011）上依據 Kimura 2-parameter模型計算群體內及群體間的平均遺傳距離，并構建線粒體ND1基因的單倍型NJ系統樹，各分支的置信度由1 000次自舉法檢驗；由Dnasp 5.0軟件 （Librado etal，2009）計算得出遺傳多樣性參數，如核苷酸多樣性Pi以及單倍型多樣性Hd等；4個群體單倍型數目、類型及分布由軟件Areliquin 3.5（Excoffier，2005）生成，最后由該軟件計算出堿基含量以及pairwise difference模型下的遺傳分化參數并進行AMOVA分析和Tajima′s D 中性檢驗。

2 結果和分析

2.1 目的片段的序列特征及群體內的序列變異

對4個不同地理群體的波紋唇魚共101尾個體的ND1基因序列進行測定，得到長度為975 bp的堿基序列。利用BLAST軟件將ND1基因的101條序列與NCBI上波紋唇魚線粒體全序列（序列號：GU296101）相應的序列進行對比，結果表明兩者之間同源性很高，有的完全一致。

4個堿基A、T、G、C在101尾個體中的平均含量分別為23.79%、27.08%、15.49%和33.64%，其中各堿基含量變化范圍在0.01%之間。即A+T（50.87%）＞G+C（49.13%），其中海南陵水群體（LC）的堿基含量為A 23.79%、T 27.08%、G 15.49%、C33.64% （A+T（50.87%）＞G+C（49.13%））；馬來西亞群體（MC）的堿基含量為A 23.80%、T 27.08%、G 15.48%、C 33.64%（A+T（50.88%）＞G+C（49.12%））；西沙群體（XC）的堿基含量為A 23.79%、T 27.09%、G 15.48%、C 33.64% （A+T（50.88%）＞G+C（49.12%））；南沙群體（NC）的堿基含量為A 23.80%、T 27.07%、G 15.49%、C 33.64%（A+T（50.87%）＞G+C（49.13%））。A+T含量大于C+G含量，表現出較為明顯的堿基組成偏倚性（見表1）。

表1 波紋唇魚4個群體ND1基因序列的堿基含量

2.2 遺傳多樣性分析

由表2可知，海南陵水、馬來西亞、西沙、南沙4個地理群體波紋唇魚的多態位點數分別為7、2、2、5，單倍型數目及其多樣性指數（Hd）分別為9/0.456、3/0.195、2/0.143、6/0.262，而核苷酸多樣性（Pi）以及平均核苷酸差異數（K）分別為 0.000 53/0.514、0.000 21/0.200、0.000 29/0.286，0.000 29/0.278，基于單倍型多樣性的比較依次為海南陵水＞南沙＞馬來西亞＞西沙，而核苷酸多樣性比較依次為海南陵水＞西沙=南沙＞馬來西亞，平均核苷酸差異數依次為海南陵水＞西沙＞南沙＞馬來西亞。數據分析表明，遺傳多樣性參數Hd、Pi和K之間不存在正向相關的關系，沒有必然的聯系。

表2 波紋唇魚4個群體ND1基因的遺傳多樣性參數及Tajima′s D 中性檢測

Tajima′D中性檢驗法被用來對不同群體波紋唇魚受到選擇作用的影響進行檢測（表2）。從中性檢測結果來看，4個波紋唇魚群體（-2.071 71、-1.512 84、-1.480 74和-2.007 09）及所有個體（-1.768 09）水平上的Tajima′s D均為負值，說明波紋唇魚經歷過近期群體擴張或瓶頸效應。

2.3 遺傳分化分析

由表3看出，群體內遺傳距離的大小依次為海南陵水 （0.000 53）＞西沙 （0.000 30）＞南沙 （0.000 29）＞馬來西亞（0.000 21），群體間的遺傳距離范圍為0.000 25（馬來西亞和西沙、馬來西亞和南沙）～0.000 41（海南陵水和西沙、海南陵水和南沙）。波紋唇魚的遺傳分化分析中，Fst很低，甚至出現了負數，表明群體間遺傳分化不明顯；而海南陵水和馬來西亞群體波紋唇魚的遺傳分化為0.354 26，且P﹤0.01，說明這兩個群體間存在遺傳分化且極顯著。

表3 波紋唇魚4個群體ND1基因群體間/群體內的K im ura 2-param eter遺傳距離（左下角）及遺傳分化（右上角）

AMOVA分析（表4）數據表明，-0.58%的變異來自群體間而100.58%的來自群體內。

表4 波紋唇魚4個群體ND1基因的AMOVA分析

2.4 單倍型分析

圖2 波紋唇魚4個群體ND1基因構建的單倍型NJ系統樹

表5 波紋唇魚4個群體的ND1基因的單倍型數目類型、頻率及分布

由軟件MEGA5.0生成的海南陵水、馬來西亞、西沙、南沙4個群體ND1基因的單倍型NJ系統樹見圖2，不同地理來源的單倍型均勻交錯分布，無明顯分支，沒有體現地理差異性。由軟件Areliquin 3.5生成的海南陵水、馬來西亞、西沙、南沙共101尾個體的ND1基因單倍型數目、類型、頻率及分布情況見表5，其中共享單倍型個數有4個，分別為Hap3、Hap5、Hap6和Hap7，比例為28.57%（4/14）。在共享單倍型中分布最廣泛的是Hap3，海南陵水23尾個體、馬來西亞18尾個體、西沙13尾個體以及南沙31尾個體均共用此單倍型，其比例高達84.16%（85/101），該單倍型在每個群體中出現的比例分別高達74.19%、90.00%、92.86%、86.10%。在共享單倍型中，除了Hap3，其他均為2個種群共享，另外10個單倍型均為獨享單倍型。

3 討論

3.1 目的片段序列特征

波紋唇魚線粒體DNA ND1基因分析得出的序列堿基含量為A+T﹥G+C。線粒體DNA中A+T的含量越高，說明該物種進化地位也高，同時A+T含量的增加也增加了密碼子第三位點上A與T顛換的可能性（Folmer etal，1994）。而4種核苷酸在mtDNA中呈不均一分布狀態，也是動物線粒體基因組共性的特征（Brown，1985）。

3.2 遺傳多樣性及種群的動態

遺傳多樣性是存在于生物個體內、單個物種內以及物種間的基因多樣性，是進化和適應性的基礎，種內的遺傳多樣性越豐富，該物種對環境的適應能力越大。衡量遺傳多樣性的指數有兩個重要指標：單倍型間的平均遺傳距離（K）和核苷酸多樣性（Pi），而Pi值考慮了各種mtDNA單倍型在群體中所占的比例，故更能精確的揭示一個群體的mtDNA的多態程度（周蕙，2006），同時是衡量群體多態程度和群體遺傳分化的重要指標之一，Pi值越大表示群體多態程度越高，反之亦然。當Pi值在 0.001 5～0.004 7 范圍內時 （Lan etal，1993），則表明遺傳多樣性處于較低水平，本研究由ND1基因序列得出的波紋唇魚整體水平的Pi值為0.000 35，說明波紋唇魚遺傳多樣性低，這可能與波紋唇魚的棲息地及人為因素有關，波紋唇魚作為珊瑚礁棲息類魚，其棲息地珊瑚礁正面臨大面積的污染，高殺傷力漁具的捕撈也對其產生了不可恢復的損傷，甚至瀕臨消失。目前波紋唇魚的野生資源有限，分布也越來越窄，這有利于個體間或群體產生基因交流，而基因交流會進一步地減少個體間的差異，使得遺傳多樣性降低。并且從中性檢測結果來看，每個群體及所有個體水平上的Tajima′sD均為負值，此結果說明這4個海域地區的波紋唇魚經歷過近期群體擴張或瓶頸效應，由一個較小的有效種群逐漸發展而來，但還未能積累核苷酸序列的多樣化 （Avise，2000）。

3.3 群體的遺傳結構

Fst常用來表示群體之間的分化程度。對于遺傳分化指數大小和分化程度的解釋，Wright提出Fst值在0.05～0.15之間表明遺傳分化達中等水平（Wright，1951）。本研究中不同群體（除海南陵水和馬來西亞群體）之間Fst很低，甚至出現了負數，說明群體間遺傳差異很小。這可能是由于各群體還沒有經過足夠長的時間和完全的地理隔離來累積足夠多的特有的突變，而海南陵水和馬來西亞群體波紋唇魚的遺傳分化大且極顯著，這可能與海南陵水這一群體地理隔離明顯有關，其遺傳多樣性參數Hd、K、Pi均高于其他群體，且群體內遺傳距離高于所有群體間遺傳距離可以共同驗證這一推測。從分子方差分析（AMOVA）來看，基本上全部的變異都是存在群體內，與Fst的結果一致。同時也暗示某一群體的變異水平超過了整體水平，此群體經歷了高度進化，從而提供了大量變異，使得群體間的變異貢獻不明顯，進一步印證了上面得出的的結論：海南陵水群體存在高度進化。

從單倍型分布及頻率中可看出這4個野生波紋唇魚群體的單倍型以Hap3為主。溯祖理論（Crandalletal，1993）認為分布最廣泛的單倍型為祖先類型，因此推測這4個群體波紋唇魚單倍型共同起源于單倍型Hap3。NJ系統樹表明4個波紋唇魚群體也沒有完全分開，而是不同群體的單倍型錯亂交織在一起。這也提示了群體間進行了廣泛的基因交流，遺傳分化水平低。

本研究基于線粒體ND1基因序列變異對海南陵水、馬來西亞、西沙和南沙4個不同地理群體的波紋唇魚進行了遺傳多樣性和遺傳分化研究，結果均顯示波紋唇魚的遺傳多樣性處于較低水平，遺傳分化水平低。由于取材的限制，雖然不能完全反映各大海域波紋唇魚群體遺傳多樣性水平和群體分化程度，也不能完全確定遺傳多樣性是否受到人為因素的影響，但為后續的波紋唇魚研究積累了遺傳多樣性參考資料，為波紋唇魚的種質資源保護工作提供一定的科學依據。

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