德國牧羊犬精液4℃保存體系的建立

趙 禹 張文才 李向黨 張匯東

一、德國牧羊犬繁育工作現狀

德國牧羊犬由于其優秀的工作能力及威武出眾的外貌特征，在我國警用犬種中一直占有較大比例，在犬種實際的繁殖工作中，遇到的問題也較多。如公犬性欲較低，不爬跨；母犬生殖道異常，不能完成自然交配等。

在育種工作中，目前國內德國牧羊犬的育種工作尚未有效的開展。社會養犬業薄弱，選育犬方式也不是以工作性能為主。而警犬基地一般各自開展選育工作，盡管有些警犬基地遵循開放式核心群育種體系，但引種有限，導致優秀血系不能有效拓展，近親現象較為嚴重，工作性能退化較為嚴重。這導致我國警方使用的德國牧羊犬一直在“引種——維持——退化——再引種”的怪圈中循環。而且，從外部環境來看，德國牧羊犬產地德國的德國牧羊犬協會（SV），由于近些年來育種目標逐漸傾向外貌性狀選擇，而弱化了德國牧羊犬工作性能的培育，使得德國本土的德國牧羊犬工作性能出現了退化的趨勢。同樣，遵循SV協會選種標準的歐洲其他國家的德國牧羊犬也出現了工作性能退化的趨勢。針對這一現狀，公安部沈陽警犬基地近年來有計劃有步驟的開展起沈陽片區德國牧羊犬聯合育種工作，目的就是盡可能搜集整合片區內優秀血系的德國牧羊犬種犬，發揮其最大價值，向同一個育種目標發展，為我國警方提供充足的工作性能優秀的德國牧羊犬犬源。

二、人工授精技術的優勢

犬的人工授精技術在犬繁殖工作中具有很多獨特優點。如：可以使不能完成自然交配的母犬受孕而獲得后代；預防公母犬直接性接觸而傳播的疾病；可以對精液質量評估增加受孕率；能夠省去母犬飼養者因配種而帶來的長途旅行的花費和不便；通過冷凍精液技術, 長期保存優良公犬的遺傳物質等。

將犬的人工授精技術應用于德國牧羊犬的繁育工作中同樣具有現實意義。如：使性欲較低的優秀公犬及不能自然交配的母犬獲得后代；人工授精技術是性別控制技術的基礎，通過流式細胞儀將X、Y精子分離后進行人工授精，可以獲得預定性別的后代；犬人工授精技術是開展警犬聯合育種工作的技術基礎，可以提高警犬聯合育種工作的效率。

而犬精液的保存技術是成功開展犬人工授精工作的重點和難點。目前，國際上通常采用精液冷藏（4℃）及精液液氮冷凍（-196℃）兩種方式保存精液。其中，精液4℃冷藏保存方法由于不需像液氮冷凍保存時經過精子細胞的冰晶期，對精子細胞造成的損傷較小，短期保存一段時間后精子質量較好，使用陰道輸精方式就可以獲得較高的受孕率，操作上相對簡單，易于掌握，成本較低，在犬人工授精中具有一定的應用價值。國外養犬發達國家已將此技術應用于犬的實際繁殖工作中，特別適用于短途犬精液的運輸，一般2～3天內到達后即進行人工授精，母犬妊娠率與自然交配妊娠率相當。相對于液氮冷凍保存唯一缺點是不能長期保存。而國內尚未見犬精液4℃冷藏保存用于人工授精的報道。

三、德國牧羊犬精液4℃保存體系的建立

下面將德國牧羊犬精液4℃保存整個實驗步驟簡述如下。

（一）采精前準備

公犬精液采集在清潔、安靜的場地或公犬圈內進行。每條公犬由所熟悉的人站立保定，為防意外可給犬戴上口籠。用0.1%的高錳酸鉀溶液清洗公犬陰莖部。

（二）精液的采集與分析

采用手握按摩法采精，按摩的速度和壓力可根據不同的公犬確定，一般情況下經過1～2min的按摩，公犬的陰莖就可充分勃起并射精，采集公犬中段富含精子的精液，采精量一般在2ml以上。

采集精液后，立即觀察精液的氣味和色澤，乳白色或淡乳白色者為正常精液，用偉力精液檢測分析系統分析精液質量參數，精子活力大于0.8，活率大于90%的用于接下來的實驗研究。

（三）精液的處理

將采集的犬精液裝入離心管中離心8分鐘，移去上清液，使用不同實驗設計的稀釋液2倍稀釋，密度在0.5×108個/ml以上，放于4℃冰箱內保存。分別于12h、24h、36h、48h后使用精子檢測分析系統分析比較各組稀釋液的保存效果，確定最佳稀釋液配方。

（四）精液稀釋液的研究配制

本實驗以國內外常用犬精液低溫保存的卵黃-Tris稀釋液為基礎，比較了不同濃度的葡萄糖與果糖對德國牧羊犬精液4℃保存效果的影響；同時研究了不同濃度的VE、還原性谷胱甘肽等抗氧化劑對德國牧羊犬精液4℃保存效果的影響。獲得了適宜德國牧羊犬精液4℃保存的穩定的稀釋液配方，使德國牧羊犬精液4℃保存48h后精子質量仍然較高，精子活力0.7以上，活率達到80%以上。

（五）人工授精

將于4℃保存48h的德國牧羊犬精液放于37℃水域鍋中1min，使用注射器將精液吸于注射器內，將輸精管插于適宜配種的發情母犬陰道內，將注射器內的犬精液注入母犬體內，之后將母犬后肢抬高，按摩母犬外陰部1～2min，完成輸精過程。

犬精液4℃保存體系的建立重點在于犬精液稀釋液的配制。本實驗研究以國外犬精液低溫保存稀釋液配方為基礎，對其進行了一定優化，用于德國牧羊犬精液4℃保存。實驗獲得了穩定可靠的德國牧羊犬精液4℃保存稀釋液配方，使德國牧羊犬精液4℃保存48h后精子質量仍然較高（精子活力0.7以上，活率80%以上），完全滿足人工授精需要，可以用于開展人工授精工作。實驗選取4頭發情母犬用于人工授精對象，將實驗中4℃保存48h的德國牧羊犬精液采用陰道輸精法輸入發情母犬體內，其中3頭母犬妊娠產仔，妊娠率達75%，平均窩產仔數7頭，仔犬發育良好。這一結果初步證明4℃保存德國牧羊犬精液一段時間后可以取得較高的母犬妊娠率及窩產仔數。同時，這一時間內，幾乎可以實現沈陽片區內任意兩個地區的運輸，從而實現人工授精技術在沈陽片區德國牧羊犬聯合育種中的應用，促進沈陽片區德國牧羊犬聯合育種工作的開展。