骨髓間充質干細胞和軟骨細胞共培養在組織工程化軟骨中的研究進展

江祖炘，譚 波，代 輝 綜述，王 躍△ 審校

(1.瀘州醫學院研究生學院2011級，四川 瀘州 646000;2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院骨科，四川 成都 610072)

理論上講，自體軟骨細胞作為種子細胞修復軟骨缺損是較為理想的，但由于軟骨細胞屬于增殖能力極弱的終末細胞，傳代能力也十分有限，易出現去分化現象;同時，來源廣、分化能力強的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為種子細胞近年研究較多，但由于定向分化比較復雜和不穩定，分化后形成的軟骨細胞易出現退化和衰老，因此單獨的軟骨細胞和單獨的BMSCs在組織工程軟骨應用中皆受限。國內外有文獻報道將BMSCs和軟骨細胞共同培養，使兩種細胞優勢互補，為優化和擴大組織工程化軟骨種子細胞源提供了可能。本文就BMSCs和軟骨細胞共培養的原理、方法和存在的問題加以綜述，為BMSCs和軟骨細胞共培養作為種子細胞進一步的研究提供理論依據。

1 BMSCs和軟骨細胞共培養成軟骨分化原理

成熟軟骨細胞能分泌含TGF－β1的一系列成軟骨生長因子，而TGF－β1為誘導BMSCs向軟骨細胞轉化的關鍵物質。Liu等［1］通過豬BMSCs和關節軟骨細胞共培養，觀察到軟骨細胞能分泌TGF－β1、IGF－1等因子并有新生軟骨樣組織形成，說明軟骨細胞可以誘導BMSCs向軟骨細胞轉化。而王結果等［2］發現 BMSCs以旁分泌或自分泌的方式調節BMSCs向軟骨細胞分化，進一步完善了共培養的原理。李拉等［3］則認為BMSCs有成軟骨分化現象，但并不明顯，而其促進軟骨細胞增殖的作用可能在共培養中起主導作用。可以看出BMSCs和軟骨細胞共培養成軟骨分化原理除了成軟骨生長因子外，細胞間的相互作用也不容忽視。

2 BMSCs和軟骨細胞共培養方法

2.1 接觸共培養 接觸共培養也稱混合共培養，為共培養的一種方法，將一定比例的兩種細胞混合在一起，相互接觸，最終誘導BMSCs向軟骨細胞分化。馮萬文等［4］利用兔自體BMSCs與軟骨細胞接觸共培養后與脫鈣骨基質復合能有效修復關節軟骨缺損。說明BMSCs能增強軟骨細胞的增殖，促進軟骨細胞基質合成，縮短軟骨細胞培養時間和減少傳代次數，可節省大量的軟骨細胞。正常成熟軟骨細胞能提供成軟骨環境，而人骨關節炎時軟骨細胞分泌的骨成形素也能成功誘導BMSCs向軟骨細胞分化［5］。Wu等［6］的報道則明確說明了接觸共培養中軟骨細胞提供了BMSCs向軟骨細胞分化的必要條件，而與BMSCs轉化而來軟骨細胞無關。這可能是新生軟骨細胞還處于細胞早期，細胞功能不全。同時，Fischer等［7］通過接觸共培養發現人關節軟骨細胞通過分泌甲狀旁腺激素相關蛋能還能抑制BMSCs的過度分化。但也有研究認為軟骨細胞對BMSCs的誘導作用僅限于新生軟骨的形成，而對于軟骨細胞外蛋白多糖的聚集和抑制BMSCs過度分化沒有作用［8］。

2.2 隔離共培養 隔離共培養是共培養中的另一種方法，將一定比例的兩種細胞放在一起，但不接觸，細胞間只有培養液的交換。田力等［9］在體外用含直徑0.22 μm孔的通透膜將兔BMSCs和軟骨細胞隔離共培養，觀察到軟骨微環境在BMSCs向軟骨分化及體內軟骨形成中具有重要作用，軟骨細胞能有效地誘導BMSCs向軟骨細胞分化并促進BMSCs體內軟骨形成。而 Acharya等［10］則通過 Traswell(插入式細胞培養皿，是一類有通透性的杯狀裝置)小室共培養人BMSCs和關節軟骨細胞，得出兩種細胞間有相互作用，BMSCs可以誘導軟骨細胞增殖，軟骨細胞可以誘導BMSCs向軟骨細胞分化的結論。對于軟骨組織形成關鍵的細胞外基質而言，王萬宗等［11］的研究證明氨基聚糖含量隨著誘導時間增加而增多，提示關節軟骨細胞分泌物具有促進BMSCs向關節軟骨樣細胞轉化的能力。而周峰等［12］的研究則說明軟骨細胞同樣能誘導老年人BMSCs向成軟骨細胞轉化。

3 不同誘導方法的比較

3.1 接觸共培養與隔離共培養比較 為比較兩種方法的優劣，Bian等［13］用人 BMSCs和軟骨細胞分別用兩種方法培養，最終發現接觸共培養比隔離共培養產生的軟骨組織具有更強的生物力學。細胞間的相互接觸促進細胞外基質的產生，從而使生成的軟骨組織更接近于正常軟骨組織。但隔離共培養更適合于觀察細胞各自的變化，是研究共培養原理的理想方法。

3.2 共培養與傳統成軟骨誘導液比較 有學者將共培養誘導形成的軟骨樣組織和傳統的含TGF－β1等誘導因子誘導的軟骨樣組織進行比較。Lettry等［14］利用馬BMSCs和軟骨細胞共培養，發現BMSCs能向軟骨細胞分化，加入TGF－β1后并沒有提高軟骨細胞Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖基因的表達。呂晶等［15］發現采用共培養方式誘導的軟骨細胞，其生物學特性與采用含TGF－β1的條件培養液誘導的軟骨細胞相比，前者優于后者，如分泌糖胺多糖的能力以及基質分泌量均較高。陳宗雄等［16］也發現共培養誘導的結果與含10 μg/L TGF－β1的誘導液結果相當，但隨著關節軟骨細胞在誘導體系中比例的增加，誘導結果明顯優于TGF－β1誘導，但這種誘導作用也存在飽和現象。或許是成熟的軟骨細胞能提供和體內更為相似的環境，所以共培養形成的軟骨組織細胞外基質較多。

4 BMSCs和軟骨細胞共培養中存在的問題

4.1 兩種細胞的最佳比例 兩種細胞的比列是共培養結果的關鍵，不同比列的兩種細胞共培養后可以得到性狀不同的新生軟骨組織，但哪種比列最好，目前還沒有統一的觀點。Tsuchiya等［17］研究說明軟骨細胞的增殖速度和細胞外基質的合成與BMSCs的比例呈正相關，但沒有給出明確比列。Kang等［18］用豬 BMSCs和軟骨細胞接觸共培養，發現BMSCs和軟骨細胞為5∶5時Ki67和Dlk1兩種關于細胞增殖和成軟骨潛能的基因含量較其他組高。而Qing等［19］則報道2∶1(兔BMSCs:兔軟骨細胞)組Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖含量顯著高于其他比例組。蔣愷等［20］將混合后的細胞依次體外及體內培養，觀察到BMSCs與軟骨細胞混合濃度比例以3∶1最好。不同的細胞比例對新生軟骨組織的特性影響較大，最佳比例還需進一步研究。

4.2 細胞種植密度、誘導時間和支架的選擇 細胞種植密度也是誘導向軟骨細胞分化的關鍵。一般認為較高密度的細胞培養有利于細胞與細胞、細胞與基質間相互作用以及細胞之間的信號傳遞，并能形成低氧濃度的環境，有利于誘導成軟骨細胞。并且高密度的細胞共培養可以延長所培養的細胞維持表型不變的時間［21］。而誘導時間和支架材料的選擇性較大，目前還很難判斷哪個最好。吳俊等［22］將5.0×107/ml終濃度的混合細胞接種于聚羥基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架上體外培養8周，然后裸鼠體內再培養6周，證明軟骨細胞能夠誘導BMSCs向軟骨細胞分化。Meretoja等［23］用 1.25×106/ml終濃度的混合細胞接種于聚甲基丙烯酸甲酯(PCL)支架上體外培養8周，同樣得出軟骨細胞能夠誘導BMSCs向軟骨細胞分化，并且干細胞能提高軟骨細胞潛能。不同的種植密度，不同的誘導時間以及支架等的選擇都會影響軟骨組織的形成，不同因素的單獨作用及相互間的作用等都還有待研究。

5 小結與展望

BMSCs和軟骨細胞作為種子細胞都有各自的優勢和不足，BMSCs和軟骨細胞共培養，取其兩種細胞優點，并相互彌補不足，為組織工程化軟骨種子細胞來源的有效方法。并通過與傳統的含TGF－β1的誘導液比較得出共培養方式誘導的軟骨細胞更接近正常軟骨細胞，更有利于作為組織工程軟骨的種子細胞并且實驗費用也較低，因此BMSCs和軟骨細胞共培養與傳統的條件誘導液相比占有一定的優勢［24］。但目前仍存在一些問題，共培養原理還需完善，共培養的方法還在不斷更新，以及兩種細胞的最佳比例、共培養的時間、細胞種植密度、三維支架材料的選擇等問題仍需要進一步探索。隨著科學技術的發展，我們充分相信BMSCs和軟骨細胞共培養在組織工程化軟骨的發展過程中具有廣闊的應用前景。

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