NVP-BEZ235對卵巢癌細胞系SKOV3增殖及體內、體外遷移的影響

秦 宇，賴慧玲，趙雪嬌，王常玉

0 引言

卵巢癌是女性第七大致死癌癥相關性疾病，并且是第二大常見婦科惡性腫瘤[1]。近30年來，雖然醫療及科研工作者在各種層面對卵巢癌進行研究、嘗試，但卵巢癌患者的5年生存率一直保持在30%左右，并未得到極大改善[2]。近年來，由于人們對卵巢癌發生的內在分子機制的了解不斷加深，更特異的分子通路靶向治療得到極大重視。其中PI3K-mTOR通路在卵巢癌中被發現普遍活化，且參與卵巢癌細胞的生存、增殖、耐藥及侵襲轉移。因此，PI3K-mTOR通路相應抑制劑雷帕霉素及雷帕霉素類似物在卵巢癌的治療過程中得到了極大重視。NVP-BEZ235是一種PI3K-mTOR 雙通路抑制劑，不僅可以顯著抑制PI3K活性，同時也能抑制mTOR復合體活性，在前列腺癌、結腸癌及乳腺癌等惡性腫瘤中通過引起細胞周期阻滯、細胞凋亡抑制腫瘤增殖[3-5]。比傳統mTOR通路抑制劑雷帕霉素及類似物更具殺傷效應。本文通過研究NVP-BEZ235對卵巢癌細胞系SKOV3體外、體內轉移的影響，檢測PI3K-mTOR通路抑制劑在治療卵巢癌方面的可能性。

1 材料和方法

1.1 儀器 全波段酶標儀(美國 Bio-tek公司)；相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；熒光體式顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；細胞培養箱(美國Termo公司)；Western Blot電泳及轉膜儀(美國 Bio-rad)。試劑：NVP-BEZ235(美國Cayman公司)；CCK-8(日本Dojindo公司)；P-AKT、P-mTOR一抗(美國Cell signal公司);GAPDH一抗(中國三鷹公司)；SKOV3卵巢癌細胞系(美國ATCC公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；Mcoy5a培養基(中國博士德公司)；胎牛血清(中國四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥物預處理 人卵巢癌細胞系SKOV3置于Mcoy5a完全培養基(10%胎牛血清，DMEM培養液)中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，細胞融合率達90%時進行胰蛋白酶消化，傳代或種于孔板進行下一步實驗。按照實驗目的分為對照組和NVP-BEZ235處理組，對照組中細胞不加NVP-BEZ235，處理組培養基中給予125 nmol/mL和250 nmol/mL NVP-BEZ235持續加藥。

1.2.2 CCK8法測NVP-BEZ235對卵巢癌細胞SKOV3增殖抑制試驗 將胰酶消化過的SKOV3單細胞懸液在調整密度后，以每孔100 μL體積，1×104接種于96孔板中，貼壁24 h后，加入含NVP-BEZ235濃度為0、125、250、500、1 000 nM的100 μL培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養至48 h，加入37 ℃預熱的Cell counting kit-8(Dojindo，日本)，繼續培養4 h，酶標儀450 nm處讀取吸光度值。計算生長抑制率(IR)：IR=[(對照組-實驗組)/對照孔]×100%。實驗重復3次。

1.2.3 構建穩定表達綠色熒光蛋白(GFP)的SKOV3細胞株 將SKOV3細胞以每孔5×104接種至12孔板中(1 mL)，融合率為30%～50%，加入GFP慢病毒，并用5 μg/polybrene提高感染率。等細胞長滿后傳代擴增。

1.2.4 免疫印跡法檢測NVP-BEZ235對PI3K-mTOR通路的抑制 胰酶消化對照組和處理組細胞，再用PBST洗3次，加細胞裂解液提取細胞總蛋白質，用BCA法測蛋白濃度后，加蛋白上樣液，加熱變性后取40 μg進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移到PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫孵育30 min，分別用P-AKT(1∶1 000)，P-mTOR(1∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜，洗滌3次，再用相應辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶4 000)孵育1 h，PBST洗膜3次，采用ECL試劑盒反應，Bio-Rad成像系統采集圖像。

1.2.5 體外遷移試驗 將消化成單細胞懸液的對照組和處理組SKOV3細胞以2×104個細胞，200 μL含2% FBS Mcoy5a培養基的體積種于transwell上層小室中，下層中加入500 μL 5% FBS Mcoy5a培養基。繼續于37 ℃細胞培養箱中培養40 h。用棉簽輕輕擦去未穿過的細胞后用PBS洗3遍，再用4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗3遍，再用結晶紫染色，后再用PBS將多余結晶紫洗凈。隨機取5個視野，取平均數，重復3次實驗。遷移抑制率=[(對照組平均數-實驗組平均數)/對照組平均數]×100%。

1.2.6 斑馬魚體內遷移試驗 對照組與實驗組細胞用正義表達綠色熒光蛋白的慢病毒轉染48 h后，用顯微注射儀注射約200個細胞于2 d大的斑馬魚胚胎卵黃囊中，每組10只。注射48 h后，用熒光體式顯微鏡觀察并拍攝、計數尾部細胞轉移情況。遷移抑制率=[(對照組平均數-實驗組平均數)/對照組平均數]×100%。

2 結果

2.1 CCK-8法檢測NVP-BEZ235抑制卵巢癌SKOV3增殖 使用濃度分別為125、250、500、1 000 nM NVP-BEZ235對SKOV3作用48 h，通過CCK-8法檢測NVP-BEZ235對卵巢癌的增殖影響，發現NVP-BEZ235在濃度為125、250 nM時，對SKOV3細胞增殖抑制差異無統計學意義(P>0.05)，而濃度在500～1 000 nM時，對SKOV3細胞有抑制增殖的作用(P<0.05)。見表1。

表1 NVP-BEZ235對SKOV3細胞體外增殖的影響

2.2 NVP-BEZ 235顯著抑制PI3K-mTOR通路 Western blot結果表明，在NVP-BEZ235濃度為125、250 nM時與對照組相比，PI3K-mTOR通路中的AKT及mTOR的磷酸化水平顯著抑制。見圖1。

2.3 NVP-BEZ235抑制SKOV3細胞體外遷移選取對卵巢癌無增殖抑制的低濃度125、250 nM NVP-BEZ235處理后的細胞種植在Transwell小室，24 h后通過隨機選取5個視野計數，結果表明，該濃度下明顯抑制SKOV3細胞的體外遷移，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1 NVP-BEZ235抑制卵巢癌SKOV3細胞中PI3K-mTOR通路

注：A：對照組，B：NVP-BEZ235 125 nM處理組，C：NVP-BEZ235 250 nM處理組

2.4 NVP-BEZ235抑制卵巢癌斑馬魚體內遷移與對照組未處理的卵巢癌細胞相比，NVP-BEZ235 250 nM處理后的細胞在斑馬魚尾部的熒光點明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)，NVP-BEZ235顯著抑制了SKOV3細胞在斑馬魚體內的轉移。見表3、圖2。

表2 NVP-BEZ235對SKOV3細胞體外遷移的影響(n=3)

注：P值為與對照組比

表3 NVP-BEZ235對SKOV3細胞體內遷移的影響(n=10)

注：P值為與對照組比

圖2 NVP-BEZ235抑制卵巢癌SKOV3細胞斑馬魚體內轉移(綠色熒光點為轉移灶細胞)

3 討論

PI3K-mTOR通路是調控細胞生長過程的關鍵通路，在多種惡性腫瘤中存在異常活化[6]。PI3K-mTOR通路可以通過多種方式激活，其中包括PTEN的缺失或突變[7]、PIK3CA的突變[8]以及mTOR復合體的調控異常[9]等等。抑制該通路可以降低腫瘤細胞增殖、引起細胞自噬，同時增加癌細胞對化療的敏感性，但是對正常細胞卻沒有影響[4]，因此，被認為是改善治療結果的一個很好的靶點。PI3K-mTOR信號通路同樣在卵巢癌中也存在異常活化，根據美國癌癥和腫瘤基因圖譜(TCGA)最近公布的數據表明，約有34%的卵巢癌樣本中存在PI3K-mTOR通路異常，提示此通路在卵巢癌的發生發展中起著至關重要的作用[10]。目前mTOR抑制劑已開發出三代，第一代以Rapamycin為代表，雖可部分抑制mTOR通路活性，但存在通過PI3K而引起生存通路ERK/RSK2、Akt和Mnk/eIF4F等的負反饋激活現象，導致療效減弱的問題[11]。第二代為mTOR的ATP競爭性抑制劑，如PP242、INK126、Torin1等，可完全抑制mTOR的激酶活性，而取得更好的腫瘤細胞殺傷效果[12]。目前，前兩代抑制劑已經有部分藥物進入臨床前期研究且取得了不錯進展。第三代以NVP-BEZ235為代表，其是一種新型的PI3K、mTOR雙通路抑制劑。不僅能在降低mTOR的激酶活性的基礎上同時抑制PI3K的激酶活性，避免了第一代mTOR抑制劑存在的負反饋激活生存通路問題，而有效地增加了mTOR通路的抑制效果。NVP-BEZ235通過拮抗PI3K/mTOR信號通路，可引起細胞周期阻滯、自噬等殺傷效應，在很多腫瘤中有很好的治療前景[6]。本研究中，隨著NVP-BEZ235濃度的增高，SKOV3的增殖能力被顯著抑制且呈劑量依賴關系。本實驗通過免疫印記法檢測到，當SKOV3細胞經NVP-BEZ235處理后，PI3K及mTOR通路得到了抑制。

卵巢癌是一種高轉移率和高復發率的疾病，復發和轉移占卵巢癌患者死亡原因的90%。如何有效地抑制卵巢癌細胞轉移，對延長卵巢癌病人的生存，改善生存質量具有極其重要的意義[13]。PI3K-mTOR通路居于調控腫瘤細胞轉移能力的核心位置。經典的腫瘤分泌因子TGFβ通過激活PI3K-mTOR，引起腫瘤細胞的上皮間質化而導致侵襲能力增強，抑制mTOR通路活性，從而能夠逆轉該過程，減少癌細胞轉移[14]。有研究表明，在胰腺神經分泌型腫瘤中，同時加入PI3K和mTOR抑制劑后，除腫瘤細胞增殖受到明顯抑制外，體內外轉移能力也大大減弱[15]。本研究中，NVP-BEZ235在不影響卵巢癌增殖的濃度劑量下，Transwell實驗證明其顯著抑制了卵巢癌細胞的體外遷移能力。本文另一新穎之處為運用了斑馬魚移植瘤這一很好的體內驗證模型，驗證了NVP-BEZ235的體內抑制活性。實驗結果證明，該藥也有很好的抑制體內轉移的功能。以上結果表明，NVP-BEZ235作為PI3K-mTOR通路抑制劑，不僅可以抑制卵巢癌的增殖，同時對于卵巢癌的轉移起到了很好的抑制作用，在治療卵巢癌方面有很好的應用前景。

參考文獻：

[1] Lowe KA,Chia VM,Taylor A,et al.An international assessment of ovarian cancer incidence and mortality[J].Gynecologic Oncology,2013,130(1):107-114.

[2] Jelovac D,Armstrong DK.Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer[J].CA:A cancer Journal For Clinicians,2011,61(3):183-203.

[3] Yasumizu Y,Miyajima A,Kosaka T,et al.Dual PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 sensitizes docetaxel in castration resistant prostate cancer[J].J Urol,2014,191(1):227-234.

[4] Mueller A,Bachmann E,Linnig M,et al.Selective pi3k inhibition by bkm120 and bez235 alone or in combination with chemotherapy in wild-type and mutated human gastrointestinal cancer cell lines[J].Cancer Chemotherapy and Pharmacology,2012,69(6):1601-1615.

[5] Cavazzoni A,Bonelli MA,Fumarola C,et al.Overcoming acquired resistance to letrozole by targeting the pi3k/akt/mtor pathway in breast cancer cell clones[J].Cancer Letters,2012,323(1):77-87.

[6] Yan-Na L,Ren-Zhong W,Zhao-Peng L.Recent developments of small molecule pi3k/mtor dual inhibitors[J].Mini Rev Med Chem,2013,13(14):2047-2059.

[7] Wallin JJ,Edgar KA,Guan J,et al.Gdc-0980 is a novel class i pi3k/mtor kinase inhibitor with robust activity in cancer models driven by the pi3k pathway[J].Molecular Cancer Therapeutics,2011,10(12):2426-2436.

[8] Jiang G,Huang Z,Zhang S,et al.Pik3ca gene mutations and amplifications in Chinese patients with ovarian clear cell carcinoma[J].Cancer Investigation,2013,31(10):639-644.

[9] Gomez-Pinillos A,Ferrari AC.Mtor signaling pathway and mtor inhibitors in cancer therapy[J].Hematol Oncol Clin North Am,2012,26(3):483-505.

[10]Cancer Genome Atlas Research N.Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma[J].Nature,2011,474(7353):609-615.

[11]Carracedo A,Ma L,Teruya-Feldstein J,et al.Inhibition of mtorc1 leads to mapk pathway activation through a pi3k-dependent feedback loop in human cancer[J].The Journal of Clinical Investigation,2008,118(9):3065-3074.

[12]Zhou HY,Huang SL.Current development of the second generation of mtor inhibitors as anticancer agents[J].Chinese Journal of Cancer,2012,31(1):8-18.

[13]Amate P,Huchon C,Dessapt AL,et al.Ovarian cancer:sites of recurrence[J].Int J Gynecol Cancer,2013,23(9):1590-1596.

[14]Lamouille S,Connolly E,Smyth JW,et al.Tgf-beta-induced activation of mtor complex 2 drives epithelial-mesenchymal transition and cell invasion[J].Journal of Cell Science,2012,125(Pt 5):1259-1273.

[15]Djukom C,Porro LJ,Mrazek A,et al.Dual inhibition of pi3k and mtor signaling pathways decreases human pancreatic neuroendocrine tumor metastatic progression[J].Pancreas,2014,43(1):88-92.