氟伐他汀對尼古丁誘導血管內皮功能障礙的保護作用

胡翠竹，蔡冬梅，胡 健

0 引言

目前全球范圍內吸煙引起的死亡率逐年升高。流行病學調查研究已經證實，吸煙是諸多心血管病危險因素中動脈粥樣硬化(AS)的獨立危險因素[1]，煙霧中的尼古丁(Nicotine)是引起心血管疾病的主要物質之一。尼古丁可降低HDL-C水平，并使LDL-C增加，減弱血管內皮細胞的屏障功能，誘發并加速AS的發生和發展。尼古丁可通過核轉錄因子-κB(NF-κB)途徑誘導細胞粘附分子的表達，引起內皮細胞功能紊亂，誘發并加速AS的發生和發展[2]。

氟伐他汀是一個全合成的他汀藥物，為羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，作用于肝臟，具有抑制內源性膽固醇的合成，降低肝細胞內膽固醇的含量，刺激LDL受體的合成，提高LDL微粒攝取，降低血漿總膽固醇濃度的作用[3]。眾多試驗證實他汀類藥物可以保護血管內皮細胞功能，延緩AS進展，明顯改善冠心病的預后，減少心腦血管疾病的終點事件[4-8]。

本實驗擬觀察尼古丁對血管內皮細胞白介素-8(Interleukin-8，IL-8)表達變化的影響，通過尼古丁誘導血管內皮細胞功能障礙，并觀察氟伐他汀對這一過程的影響，探討氟伐他汀是否會影響尼古丁誘導的血管內皮細胞功能紊亂，以及氟伐他汀改善尼古丁引起內皮細胞功能紊亂致AS作用的相關機制。

1 材料和方法

1.1 試劑 DMEM培養基(Sigma公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)；尼古丁(中國醫科大學發育生物教研室翟秀巖老師惠贈)；NF-κB抑制劑PDTC(Sigma公司)；NF-κB活性檢測試劑盒(Active Motif 公司)；IL-8 ELISA檢測試劑盒(吉泰生物科技有限公司)。

1.2 細胞培養及細胞分組 HUVEC株CRL-1730購自于上海拜力生物科技有限公司。細胞培養基為含有100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM培養液；培養條件為5%的CO2，37 ℃；0.25%胰蛋白酶消化傳代，將傳代生長至80%融合狀態時的內皮細胞用無血清的DMEM培養液饑餓16 h后同步用于實驗。分為4組：①空白對照組：無血清培養基替代處理因素；②尼古丁組：100 nmol/L 尼古丁孵育內皮細胞24 h；③氟伐他汀組：10-5mol/L氟伐他汀孵育內皮細胞1 h后，100 nmol/L 尼古丁孵育內皮細胞24 h；④NF-κB抑制劑組：100 μmol/L PDTC和100 nmol/L 尼古丁孵育內皮細胞24 h，收集細胞標本及培養液。

1.3 IL-8蛋白的定量檢測 收集的細胞培養液離心 2 000×g，10 min，除去懸浮的細胞和顆粒，收集上清，儲存于-20 ℃待測IL-8水平。ELISA測定步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4 細胞NF-κB的活性 收集細胞后按照TransAM(tm)NF-κBp50檢測試劑盒說明書進行，檢測細胞NF-κB的活性，以對照組的數值為1進行半定量分析。

2 結果

2.1 氟伐他汀對尼古丁誘導血管內皮細胞NF-κB活性的影響 尼古丁組NF-κB活性較空白對照組明顯升高(P<0.05)；氟伐他汀組NF-κB活性較尼古丁組顯著下降(1.26±0.12 vs 2.95±0.17，n=3，P<0.05)。見圖1。

圖1 內皮細胞NF-κB活性的組間比較

2.2 氟伐他汀對尼古丁誘導血管內皮細胞IL-8表達的影響 NF-κB抑制劑組較尼古丁組IL-8的蛋白表達明顯下降(1.01±0.12 vs 7.03±0.22，n=3，P<0.05)，氟伐他汀組較尼古丁組IL-8的蛋白表達明顯下降(1.45±0.11 vs 7.03±0.22，P<0.05)，見圖2。

圖2 內皮細胞培養液中IL-8蛋白表達的組間比較

3 討論

流行病學研究表明，吸煙是心腦血管疾病、癌癥、慢性阻塞性肺疾病等多種疾病的獨立危險因素[9-11]，全球每年有500萬人死于與吸煙有關的疾病，長期吸煙者的心血管疾病發病率比普通人群高2～3倍。香煙煙霧中對人體危害最大的物質之一是尼古丁，長期攝入尼古丁后肺癌、胃潰瘍、冠心病、高血壓等疾病的發病率增加，尤其是尼古丁與心腦血管系統疾病如高血壓、高血脂、冠心病、腦卒中等疾病關系密切[12]。血管內皮細胞功能障礙是AS發生發展的始動環節。早期實驗觀察到，吸煙個體中出現血管內皮細胞腫脹、胞漿空泡形成、細胞連接疏松出現、線粒體水腫、內皮細胞下水腫等形態學變化。尼古丁可引起內皮細胞相同的形態學改變，并導致內皮細胞滲透性增加；亦可誘導內皮細胞粘附分子ICAM-1及VCAM-1 的表達[13-14]。

IL-8 屬于CXC 類趨化因子，誘發單核細胞的聚集和粘附，在AS的發生發展中起重要作用。NF-κB屬于NF-κB/Rel家族，主要是由p50/p65組成的異源二聚體，是一種多極性基因調控蛋白。與內皮細胞活化有關的各種刺激可通過活化NF-κB起作用。近年研究結果顯示，尼古丁可使內毒素刺激下的人肺泡巨噬細胞MAPK磷酸化、IL-8表達增加；體內研究證實，尼古丁可通過N-乙酰膽堿能受體，刺激產生過氧化亞硝酸鹽，繼而活化NF-κB，從而升高中性粒細胞IL-8的表達，引起吸煙個體的白細胞增多癥。本實驗觀察了尼古丁對人臍靜脈內皮細胞IL-8表達的影響，結果顯示，尼古丁組人臍靜脈內皮細胞IL-8的表達較空白對照組明顯升高，同時NF-κB活性升高，并且NF-κB特異性抑制劑可阻斷尼古丁誘導的IL-8的表達。本研究結果表明，尼古丁可通過觸發NF-κB的活化，從而誘導IL-8的表達，在AS的發生和發展中起重要作用。

氟伐他汀鈉可降低LDL-C水平，改善內皮細胞功能，防止AS的進展[15]。本實驗結果顯示，氟伐他汀組NF-κB的活性較尼古丁組明顯抑制；本實驗結果已經證實，尼古丁可通過激活人臍靜脈內皮細胞NF-κB的活性，從而誘導IL-8的表達；氟伐他汀可拮抗尼古丁誘發的NF-κB的活化，抑制尼古丁誘導的IL-8的表達，提示氟伐他汀可能通過抑制尼古丁誘導的NF-κB活化，從而抑制尼古丁誘導的IL-8的表達。本實驗證實，氟伐他汀可通過抑制尼古丁誘導的NF-κB的活化，抑制尼古丁誘導的趨化因子的表達，為氟伐他汀改善吸煙患者內皮細胞功能提供新的理論依據。

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