加紅生化湯中阿魏酸的含量測定

賴水容,陳行愉,韓麗萍

0 引言

加紅生化湯是本院臨床科室在長期臨床實踐和用藥經驗總結下，根據著名古方生化湯[1]組方原理，進一步完善配方和改進生產工藝技術生產的純中藥制劑，處方由當歸、川芎、桃仁、姜炭、炙甘草、紅花6味中藥藥材所組成，具有活血去瘀、溫經止痛的功效，臨床常用于產后子宮收縮痛、子宮復舊不良及常見婦科疾病。其中當歸與川芎均為加紅生化湯中主藥，兩味藥的功效主治[2]與制劑功效有密切關系。研究表明，阿魏酸是川芎、當歸等多種中藥的有效成分之一，具有多方面的生物活性[3-4]，許多生藥及其制劑常選用阿魏酸的含量作為其質量控制指標[5]。目前該制劑質量標準草案中尚未建立相關含量測定方法控制其質量。所以，本研究建立了加紅生化湯中阿魏酸的高效液相色譜含量測定，保證該制劑質量，實現臨床用藥安全有效。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司，配有G1315B 紫外檢測器、G1312A雙泵、G1313A自動進樣器和CAG Bootp Server色譜工作站)；BP211D型電子天平(Made by Sartorius)等；阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：11073-201012)；甲醇為色譜純，水為超純水，乙酸乙酯、冰醋酸均為分析純；加紅生化湯(本院制劑，0.86 g/mL，批號：110311、110715、120113)。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.3%冰乙酸溶液(30∶70)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：323 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。在此條件下對阿魏酸溶液進行分離，用外標法按峰面積定量計算。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品約10 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。實驗時吸取儲備液1 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即制成含阿魏酸19.76 μg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取加紅生化湯(批號：110715)，搖勻，精密量取10 mL，置分液漏斗中，精密加乙酸乙酯20 mL，輕微振搖，放置至分層，分離乙酸乙酯層提取液。按上述操作重復3次，合并乙酸乙酯層提取液，置水浴鍋上(100 ℃)蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 按該制劑處方稱取不含當歸、川芎的其他藥材，按制劑的制備工藝制成湯劑，然后按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液，即得。

3 結果

3.1 系統適用性試驗 按“2.1”項色譜條件，精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL進樣測定，結果陰性對照在與對照品、供試品相同保留時間處，無干擾峰出現(見圖1)，因此確定處方中其他中藥材成分對阿魏酸的含量測定不產生干擾。

圖1 加紅生化湯中阿魏酸的HPLC色譜分析圖

3.2 線性關系考察 分別精密吸取儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻，精密吸取上述對照品溶液各10 μL進樣測定。以進樣量為橫坐標(X)、峰面積值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，計算回歸方程。結果，計算得線性方程為Y=57 765 X-47.898(R2=0.999 8)，線性范圍為9.88～98.8 μg/mL。

3.3 精密度試驗 精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.1”項色譜條件測定，連續進樣6次，記錄各色譜圖的峰面積。結果計算得峰面積相對標準偏差RSD為0.94%(n=6)，表明儀器精密度良好。

3.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于室溫下放置0、1、2、3、4、5、6、8、10 h，由同一操作人員精密吸取10 μL進樣測定。測得供試品中阿魏酸峰面積的相對標準偏差RSD=1.3%(n=9)，表明供試品中阿魏酸在10 h內比較穩定。

3.5 重復性試驗 取同一批(批號：110715)的加紅生化湯適量，按供試品溶液的制備方法操作，按“2.1”項色譜條件測定，進行7次平行試驗，計算得供試品中阿魏酸的平均含量為28.43 μg/mL，其相對標準偏差RSD為2.1%(n=7)，表明本方法重復性良好。

3.6 加樣回收試驗 精密量取已測定含量的供試品6份(測得阿魏酸含量為28.43 μg/mL)5 mL，精密吸取上述儲備液各1.0 mL，超純水各4.0 mL，按供試品溶液的制備方法制備樣品溶液。精密吸取上述樣品溶液各10 μL進樣測定，計算得樣品中阿魏酸的平均回收率為99.07%，RSD為1.4%(n=6)。見表1。

表1 加樣回收試驗結果

3.7 樣品含量的測定 取3批加紅生化湯，按供試品溶液的制備方法處理，每批制備3份供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，計算得供試品中阿魏酸的平均含量，見表2。

表2 樣品測定結果

4 討論

4.1 測定方法的考察 《中華人民共和國藥典》2010年版一部“當歸”項下含量測定項采用高效液相色譜法測定阿魏酸的含量。關于阿魏酸的含量測定方法文獻報道較多，如高效液相色譜法[6-8]、氣相色譜法[9]、薄層掃描法[10]、毛細管電泳法[9]等，由于高效液相色譜法具有快速、方便、靈敏、專屬性強等特點，已經被廣泛應用于藥物的含量測定、組成分析、質量控制等方面。因此，本研究參照《中華人民共和國藥典》2010年版一部“當歸”項下含量測定項下的方法測定了該制劑提取物中阿魏酸的含量，并進行了方法學考察。

4.2 預處理方法的選擇 參考文獻[10-11]，提取阿魏酸的方法主要有超聲提取法和溶劑萃取法，本研究考察了上述兩種方法，通過試驗結果選擇溶劑萃取法作為加紅生化湯中阿魏酸的提取方法；同時還考察了提取溶媒的種類和用量，用乙酸乙酯與乙醚比較，試驗結果表明，乙酸乙酯的提取效率明顯優于乙醚。

4.3 檢測波長的選擇 按紫外分光光度法，用甲醇作為空白對照溶液，制備阿魏酸對照品的甲醇溶液，在190～400 nm波長范圍內進行掃描。結果顯示，阿魏酸在323 nm波長處有最大吸收，故選擇323 nm作為檢測波長。

4.4 流動相的選擇 本研究參照中國藥典2010版一部川芎和當歸含量測定項下的方法，對色譜條件中的流動相進行了考察，選擇甲醇-1%冰醋酸溶液(30∶70)和乙腈-0.085%磷酸溶液(17∶83)作為流動相進行試驗。結果顯示，用甲醇-1%冰醋酸溶液(30∶70)的分離度比用乙腈-0.085%磷酸溶液(17∶83)的分離度大，且拖尾因子較小。通過進一步實驗，調整流動相的酸度使阿魏酸成分保持穩定。結果表明，用甲醇-0.3%冰醋酸溶液(30∶70)作為流動相時，出峰時間適中，且基線平穩，故選擇其作為本研究的流動相。

參考文獻：

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