硫化氫聯(lián)合亞低溫對肢體缺血再灌注后大鼠心肌損傷的影響

常國江，劉 濤*，劉志成，章以杰，林 俊，田苗苗，宋曉麗，王 彬

0 引言

肢體缺血再灌注在臨床中較為常見，如斷肢再植及骨科中長時間應(yīng)用止血帶等，隨著肢體缺血時間的延長，除造成肢體自身的缺血再灌注損傷，還可通過血流轉(zhuǎn)移到遠隔組織器官如心臟，造成一種間接損傷[1]，因此，如何減輕肢體缺血再灌注遠隔器官的損傷，是臨床急需解決的難題。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(ERS)是細胞對內(nèi)外環(huán)境變化的一種適應(yīng)性反應(yīng)，有助于細胞和生命個體的存活；然而，應(yīng)激過度可引起細胞凋亡，導(dǎo)致疾病。研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)參與肢體缺血再灌注所致心肌損傷的病理過程[2]。亞低溫是保護缺血器官最有效的方法之一[3-6]。研究顯示，亞低溫治療可有效減少心搏驟停及心肺復(fù)蘇對心肌的損傷，降低心肌耗氧量，改善心功能[7]。硫化氫(H2S)作為第三種氣體信號分子，在心血管系統(tǒng)中的研究價值倍受關(guān)注。研究顯示，H2S可明顯減輕急性缺血所致的心肌損傷，改善心功能，起到心肌保護作用[8]。但H2S聯(lián)合亞低溫對肢體缺血再灌注大鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響尚無相關(guān)報道，本研究擬評價H2S聯(lián)合亞低溫對肢體缺血再灌注后大鼠心肌損傷的影響。

1 資料與方法

1.1 分組 健康雄性Wistar大鼠60只(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，體重260～300 g，采用隨機數(shù)字表法，將其隨機分為5組(n=12)：假手術(shù)組(S組)、肢體缺血再灌注組(IR組)、硫氫化鈉組+IR組(H組)、亞低溫組+IR組(M組)和硫氫化鈉聯(lián)合亞低溫+IR組(HM組)。

1.2 方法 參照文獻[9]提供的方法制備肢體缺血再灌注動物模型：以橡皮止血帶綁扎雙后肢根部造成肢體缺血3 h，之后松開止血帶使肢體血流再灌注3 h，應(yīng)用激光多普勒(PriFlux 5001型，Perimed)監(jiān)測血流被阻斷為缺血成功標志。S組動物給予同樣的麻醉操作，只是用彈力橡皮帶環(huán)繞大鼠雙后肢，但不結(jié)扎。IR組動物使雙后肢缺血3 h后再灌注3 h。H組和HM組動物于再灌注前10 min腹腔注射NaHS(28 μmol/kg)，其余組注射等容量生理鹽水，而M組和HM組于雙下肢缺血后將大鼠置于冰袋上行體表降溫，使直腸溫于15 min內(nèi)降至32～33 ℃，并維持3 h；其余組采用白熾燈維持直腸溫36～37 ℃。再灌注3 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉下，開胸分離并切左心室心肌組織，PBS清洗，以40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋。

取固定的心肌組織，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化情況。

TUNEL細胞凋亡按試劑盒說明書用TUNEL原位法測定凋亡指數(shù)。細胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒且具備凋亡細胞形態(tài)學(xué)特征判定為凋亡細胞。Image.Pro Plus v 5.1圖像分析軟件自動選取最有意義的5個視野，每個視野計算陽性細胞所占全部細胞的百分數(shù)，最后計算均值，獲得凋亡細胞的百分率，用凋亡指數(shù)表示。凋亡指數(shù)(%)=(凋亡細胞核計數(shù)/總細胞核計數(shù))×100%。

Western blot法測定葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)和半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase-12)蛋白表達，取-80 ℃凍存心肌標本加入裂解液中，剪碎后移入1.5 mL EP 管中，4 ℃ 12 000 r/min離心25 min，取上清液進行蛋白定量。SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，恒壓電泳95 V，室溫1 h，4 ℃孵育過夜，按0.1 mL/cm2膜面積加入1∶500一抗，雜交2 h，封閉液漂洗后按0.1 mL/cm2膜面積加入1∶500二抗，搖床雜交2 h，漂洗后加顯色劑，避光顯色2～5 min，條帶出現(xiàn)，終止反應(yīng)。以β-actin作為內(nèi)參，進行比較。采用吸光度掃描分析軟件Quantity one(Bio Rad公司，美國)測定每條帶的吸光度值。將相對吸光度值作為統(tǒng)計學(xué)分析的原始數(shù)據(jù)，去除蛋白不均衡降解造成的誤差。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下心肌組織形態(tài)學(xué)變化 光鏡下S組心肌纖維排列整齊，細胞核均勻一致，紋理清晰；IR組心肌細胞腫脹、變性，細胞質(zhì)紅染，細胞核減少，可見壞死纖維斷裂，纖維間隙增寬，周圍炎性細胞浸潤和紅細胞滲出；H組和M組心肌纖維排列較整齊，間隙減小，細胞輕度腫脹；HM組心肌纖維排列基本恢復(fù)正常，細胞邊界清晰，排列規(guī)則，稍顯疏松。見圖1。

2.2 大鼠心肌組織凋亡指數(shù)GRP78和Caspase-12蛋白表達比較 與S組比較，IR組、H組、M組和HM組心肌細胞凋亡指數(shù)升高，GRP78和Caspase-12蛋白表達上調(diào)(P<0.05)；與IR組比較，H組、M組和HM組心肌細胞凋亡指數(shù)降低，GRP78和Caspase-12蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；與NaHS組和M組比較，HM組心肌細胞凋亡指數(shù)降低，GRP78和Caspase-12蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；NaHS組和M組的心肌細胞凋亡指數(shù)、GRP78和Caspase-12蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表l。

圖1 肢體缺血再灌注后大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化的光鏡觀察(HE，×200)

表1各組大鼠心肌組織凋亡指數(shù)、GRP78和Caspase-12的蛋白表達比較(n=12)

注：*與S組比較，P<0.05；#與IR組比較，P<0.05；△與HM組比較，P<0.05

3 討論

本研究參照文獻[9]采用橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢3 h，再灌注3 h的方法建立大鼠肢體缺血再灌注模型。光鏡下IR組心肌細胞腫脹、變性，細胞質(zhì)紅染，細胞核減少，可見壞死纖維斷裂，纖維間隙增寬，周圍炎性細胞浸潤和紅細胞滲出，提示肢體缺血再灌注誘發(fā)心肌損傷模型制備成功。

本研究參照文獻[10]選擇腹腔注射NaHS(28 μmol/kg)。參照文獻[11]采用體表降溫的方法使大鼠直腸溫于再灌注開始15 min內(nèi)降至32～33 ℃，并維持3 h。本研究結(jié)果表明，H2S聯(lián)合亞低溫可減輕肢體缺血再灌注大鼠心肌細胞損傷，且保護作用強于兩者單獨應(yīng)用。

GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境極度敏感，很多能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激變化的因素都能直接或間接引起GRP78表達的改變，如高血糖、高血壓、氧化應(yīng)激、炎癥等因素都可引發(fā)其蛋白大量釋放[12]。Caspase-12僅存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，是以酶原的形式位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細胞質(zhì)面，適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，有利于細胞內(nèi)鈣和蛋白質(zhì)加工等穩(wěn)態(tài)恢復(fù)正常，增強細胞耐受應(yīng)激刺激的能力；持續(xù)而嚴重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細胞凋亡，造成細胞損傷，因此，Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致凋亡途徑中的關(guān)鍵凋亡蛋白[13-14]。本研究選用GRP78和Caspase-12作為反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的指標，結(jié)果表明，H2S聯(lián)合亞低溫可通過下調(diào)心肌細胞GRP78和Caspase-12蛋白表達，降低心肌細胞凋亡指數(shù)，減輕大鼠肢體缺血再灌注心肌損傷。亞低溫下調(diào)心肌細胞GRP78和Caspase-12蛋白表達的機制可能是：肢體缺血再灌注時，ATP合成減少致使離子轉(zhuǎn)運功能障礙、大量自由基的產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等均可導(dǎo)致新合成的蛋白質(zhì)蛋白組裝折疊抑制[15]，啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。未折疊蛋白聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)致使GRP78優(yōu)先與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白結(jié)合，從而與跨膜蛋白PERK、IRE1和ATF6解離，激活下游的信號通路，即通過激活生長停止和DNA損傷誘導(dǎo)基因153和Caspase-12等引起細胞凋亡[16]。GRP78表達水平上調(diào)可抑制與PERK、IRE1和ATF6的解離，從而抑制以上3個通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而減少細胞凋亡[17]。H2S減輕肢體缺血再灌注后大鼠心肌損傷，可能與以下幾個方面有關(guān)：①通過興奮KATP通道[18]。H2S是目前所知的唯一的內(nèi)源性氣體性的平滑肌KATP通道開放劑，可使K+外流增加，心肌細胞膜超極化，縮短動作電位時程，從而影響電壓門控式Ca2+通道，使其活性減低，故Ca2+內(nèi)流減少，細胞內(nèi)Ca2+超載降低，減輕缺血缺氧時心肌細胞的損傷[19]。②H2S也可以直接抑制血管平滑肌上的電壓門控式Ca2+通道，降低細胞內(nèi)Ca2+超載。③通過激活蛋白激酶C及絲裂素活化蛋白酶系統(tǒng)而發(fā)揮抗炎癥抗氧化應(yīng)激的保護作用[20]。是否還有其他機制有待進一步研究。

綜上所述，H2S聯(lián)合亞低溫可減輕肢體缺血再灌注后大鼠心肌損傷，其機制與下調(diào)心肌細胞GRP78和Caspase-12蛋白表達、減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

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