金銀花-山銀花水提液不同配比體外抗氧化作用研究

田 磊，蔣寶平，何 苗，李 申，樊曉峰*

0 引言

金銀花作為常用中藥材，具有清熱解毒、涼散風寒的功效。《中國藥典》2000年版及之前版本將金銀花和山銀花作為一個品種收載，2005年版和2010年版將其分開收載[1]。金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花；山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.、紅腺忍冬L.hypoglaucaMiq.、華南忍冬L.confusaDC.或黃褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花[2]。金銀花和山銀花都含有黃酮類和有機酸類成分，具有清除人體超氧離子自由基的作用，在抗衰老、改善血管功能與提高機體免疫力等方面均具有重要作用[3]，但金銀花較山銀花昂貴。因此，能否用山銀花代替金銀花，或者兩者混合使用是否能實現單用金銀花的效果是臨床關注的問題，目前，二者以不同的配比合用之后抗氧化作用如何變化，未見相關文獻報道。本研究選擇金銀花和山銀花水提液的不同配比(1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶1)，比較金銀花和山銀花水提液合用后體外抗氧化作用，為合理應用金銀花和山銀花提供一定的依據。

1 材料

1.1 藥品與試劑 中藥金銀花、山銀花購自亳州市豪門中藥飲片有限公司，金銀花經鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，山銀花經鑒定為忍冬科植物灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz的干燥花蕾或帶初開的花。

鹽酸(上海中試化工總公司，批號：20100913)，鄰苯三酚(遵義林源醫藥化工有限責任公司，批號：101120)，水楊酸(成都市科龍化工試劑廠，批號：20100804)，無水乙醇(南京化學試劑有限公司，批號：11031410288)，硫酸亞鐵(上海久億化學試劑有限公司，批號：20100108)，雙氧水(成都市科龍化工試劑廠，批號：20110114)，DPPH (ALDRICH公司，批號：D913-2)，改良型RPMI-1640培養基(Hyclone，批號：NWCO387)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS，浙江天杭生物科技有限公司，批號：100517)，雙抗(青霉素—鏈霉素，GiBCO，USA，批號：15140)，噻唑藍(MTT，Amresco，批號：0793)，二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma，批號：D5879)，胰蛋白酶(Trypsin，USA，Sigma，批號：27250018)，PBS粉末(福州邁新恒武技術開發有限公司，批號：11030202Y)。乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(批號：20110625)，一氧化氮(NO)檢測試劑盒(批號：20110625)，微量丙二醛(MDA)檢測試劑盒(批號：20110625)。

1.2 細胞株 人臍靜脈內皮細胞(HUVECS)，南京凱基生物技術發展有限公司。

1.3 儀器 JA-1203電子天平：上海天平儀器廠；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；AY120型分析天平：Shimadzu corporation，Japan；酶標儀：SPECTRA MAX190型酶聯免疫檢測儀，Molecular Devices；CHK-213倒置顯微鏡，OLYMPUS；5% CO2培養箱，Forma311，USA；ELS-10T生命科學型超純水機，南京易普易達科技發展有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠。

2 方法

2.1 藥品的提取 金銀花和山銀花的水提液采用文獻方法[4]提取。根據預試驗結果，將金銀花與山銀花水提液按照1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶1混合制成混合液，并按實驗要求配制成所需濃度。

2.2 抗氧化活性篩選方法

2.2.1 DPPH·自由基清除率的測定[5]配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液，待測樣品以無水乙醇溶解并稀釋成不同濃度的溶液。按以下計算公式中的方法加樣，室溫下反應30 min，在波長517 nm處測定吸光值。每樣重復3次，取平均值，按下式計算自由基清除率：K= [1-(Ai-Aj)/Ac]×100%，式中Ai為2 mL DPPH溶液加2 mL待測溶液的吸光值；Aj為2 mL待測溶液加2 mL乙醇的吸光值；Ac為2 mL DPPH溶液加2 mL乙醇的吸光值。

2.2.2 羥自由基(·OH)清除率的測定[6]在試管中依次加9 mmol/L水楊酸—乙醇溶液0.5 mL，0.5 mL不同濃度的待測樣品，9 mmol/L Fe2+溶液(現配)0.5 mL，3.5 mL蒸餾水，最后加入8.8 mmol/L H2O25 mL啟動Fenton反應，37 ℃反應30 min，搖勻后于510 nm處測定吸光值A1。每樣重復3次，取平均值，下列公式計算羥自由基的清除率：K=[1-(A1-A2)/A3]×100%。式中A1為加入9 mmol/L Fe2+溶液測得的吸光值；A2為以0.5 mL 蒸餾水代替9 mmol/L Fe2+溶液測得的吸光值；A3為0.5 mL蒸餾水代替待測樣品測得的吸光值。

2.2.3 超氧陰離子(O2-·)清除率的測定[6]采用鄰苯三酚自氧化法測定對超氧陰離子自由基的清除作用。取10 mmol/L PBS緩沖液4.5 mL (pH 8.3)與100 μL不同濃度的待測樣品混合，于25 ℃恒溫15 min，取混合液3 mL加入45 mmol/L 鄰苯三酚100 μL，搖勻，反應3 min后于420 nm處測定吸光值A1。每樣重復3次，取平均值，按下式計算超氧陰離子自由基的清除率：K= [1-(A1-A2)/A3]×100%，式中A1為4.5 mL PBS緩沖液加100 μL待測樣品，加100 μL鄰苯三酚溶液的吸光值；A2為4.5 mL PBS緩沖液加100 μL10 mmol/L HCl加100 μL蒸餾水的吸光值；A3為4.5 mL PBS緩沖液加100 μL鄰苯三酚加100 μL蒸餾水的吸光值。

2.2.4 內皮細胞的培養和過氧化氫造模濃度篩選[7]HUVECs按照常規方法培養，取細胞濃度為1×105/mL，接種于96孔板，待細胞長滿單層融合后，棄去上清，加入不同濃度的過氧化氫使其終濃度為300、200、150、100、50 μmol/L，空白對照組不加任何溶液，繼續培養12 h后棄去培養基，每孔加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h后棄去MTT溶液，每孔加入200 μL DMSO后室溫振搖10 min，使結晶充分溶解。選擇490 nm，在酶標儀上測定每孔的吸光值。按抑制率公式，計算H2O2對HUVECs細胞的生長抑制作用。生長抑制率(%)=(空白組OD-給藥組OD)/(空白組OD-調零孔OD值)×100%。

2.2.5 藥物對HUVECs上清中LDH、NO含量的影響[8]將細胞濃度調整為1×105/mL，接種于24孔板上繼續培養，待細胞長滿單層融合后棄去上清，以含0.5%血清的培養液培養12 h，使其同步化生長用于試驗。分組：空白對照組，用無血清的1640培養液；模型組，無血清的培養液+60 μmol/L H2O2作用12 h；不同濃度樣品組，加入含有不同濃度樣品的培養液預孵2 h后，換為含有60 μmol/L H2O2的培養液作用12 h，收集培養液試劑盒檢測。

3 結果與分析

3.1 金銀花-山銀花水提液不同配比清除DPPH·自由基的能力 金銀花-山銀花水提液不同配比均具有清除DPPH·自由基的能力，其不同配比清除DPPH·的IC50值分別為10.41、5.68、6.18、20.99、4.28 mg/mL。根據IC50值的大小，金銀花-山銀花不同配比清除DPPH·自由基的能力大小順序為：0∶1>2∶1>1∶1>1∶0>1∶2。見圖1。

3.2 金銀花-山銀花水提液不同配比清除羥自由基(·OH)的能力 通過Fenton反應體系產生·OH，可以測定各提取液對·OH的清除能力。由于藥液帶有顏色，為了排除藥液本身對實驗結果的干擾，濃度控制在250 mg/mL范圍內。本研究結果表明，金銀花-山銀花不同配比均具有清除·OH的能力，其不同配比在濃度允許范圍內清除·OH能夠達到的最大抑制率的順序依次為：2∶1>0∶1>1∶1>1∶2>1∶0。見圖2。

圖1 不同配比清除DPPH·自由基的能力

圖2 不同配比清除羥自由基的能力

3.3 金銀花-山銀花水提液不同配比清除超氧陰離子(O2-·)的能力 本研究采用硝基四氮唑藍還原法，通過檢測吸光度的變化確定提取物清除O2-·的能力大小。由于藥液帶有顏色，為了排除藥液本身對實驗結果的干擾，將濃度控制在250 mg/mL范圍內。結果顯示，金銀花-山銀花不同配比均具有清除O2-·的能力，其不同配比在濃度允許的范圍內清除O2-·能夠達到的最大抑制率的順序依次為：1∶0>2∶1>1∶1>1∶2>0∶1。見圖3。

圖3 不同配比清除超氧陰離子的能力

3.4 金銀花-山銀花水提液不同配比對H2O2誘導HUVECs細胞損傷的影響

3.4.1 H2O2濃度的篩選 計算不同濃度的H2O2對HUVECs細胞的生長抑制率并計算半數抑制率后，將H2O2濃度最終確立為60 μmol/L，見表1。

表1 不同濃度H2O2對HUVECs細胞增殖抑制率的影響

3.4.2 金銀花-山銀花水提液不同配比對H2O2誘導HUVECs細胞損傷的影響 H2O2損傷后，模型組細胞活力明顯下降，不同濃度藥物干預后，細胞H2O2的損傷程度較模型組低。H2O2損傷后，模型組細胞LDH釋放量明顯增加，不同濃度藥物干預后可明顯減少HUVECs細胞釋放LDH。H2O2損傷后，模型組細胞上清中NO含量減少，藥物干預后使細胞上清中NO含量增加。各指標結果綜合顯示，金銀花-山銀花水提液能夠對抗H2O2誘導的HUVECs細胞損傷，作用強弱依次為：1∶0>2∶1>1∶2>1∶1>0∶1。見表2。

表2 金銀花-山銀花水提液不同配比對抑制HUVEC細胞H2O2損傷的作用及對細胞中LDH和NO的影響(n=3)

4 討論

1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)有單電子，在517 nm處有強吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數量成定量關系，所以，可用分光光度計進行快速的定量分析。超氧陰離子自由基(O2-·)、羥基自由基(·OH)等活性氧自由基是在機體代謝過程中產生的。在某些病理情況下，許多疾病，如動脈粥樣硬化、心腦血管疾病、中樞神經系統功能障礙、糖尿病、癌癥及肝臟的化學毒性反應、衰老、休克、炎癥等病理過程的發生都直接或間接與自由基的損傷有關[9-11]。體外抗氧化實驗結果顯示，金銀花-山銀花水提液不同配比各劑量組均具有抗氧化作用，其中金銀花-山銀花2∶1組綜合效果最佳。

血管內皮細胞功能與心血管的發生和發展密切相關。H2O2是經典的氧化劑，可使多種細胞氧化損傷，促進羥自由基的產生，誘導細胞膜脂質過氧化反應。本實驗采用60 μmol/L H2O2作用于HUVECs細胞，細胞活力明顯下降，金銀花-山銀花不同配比組干預后可以明顯抑制H2O2的損傷，抑制效果以金銀花-山銀花1∶0組最強，2∶1組次之。LDH反映細胞膜完整性和細胞收到損傷與死亡程度[12]。內皮細胞合成的NO是一種內源性抗氧化劑，能抑制多種凋亡刺激因素引起的細胞損傷[13]。本研究結果顯示，金銀花-山銀花不同配比能夠使受損細胞NO的含量增加、LDH釋放減少，其中金銀花-山銀花1∶0組作用最強，2∶1組次之。

綜上所述，金銀花-山銀花不同配比均有一定的抗氧化作用，尤其是金銀花-山銀花2∶1配比體外抗自由基、抗氧化及保護H2O2損傷的HUVECs細胞的作用最佳，為金銀花及山銀花的應用提供了一定的理論依據。

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