華蟾素對人膽管癌細胞QBC939抑制作用研究

宋艷麗，章 激，曹軍華，吳 倩，張玉潔

0 引言

華蟾素注射液(Cinobutacini injection)是我國研發的抗腫瘤中藥制劑，為陰干的中華大蟾蜍皮提取加工而制成，其有效成分總稱為蟾蜍毒素類，具有清熱解毒、利水消腫、化淤潰堅等作用[1]，目前已經成為我國臨床上應用較為廣泛的抗腫瘤中藥制劑之一。已有的研究表明，華蟾素對原發性肝癌、白血病、胰腺癌等效果較好[2-3]，尤其對消化道腫瘤具有較好的療效。近年來，隨著對華蟾素藥理學研究的進一步深入，已分離出其主要活性成分為蟾毒內酯類化合物，屬強心苷類化合物，包括蟾毒靈(Bufalin)、脂蟾蜍配基(Resibufogenin)、華蟾素毒基(又稱華蟾毒精Cinobufagin)等[4]。臨床應用以及基礎實驗研究證實，華蟾素及其含有的活性成分對多種人腫瘤細胞均有不同程度的抑制作用，還可促進凋亡、誘導分化及提高機體免疫功能等。但是，目前國內外對華蟾素抗腫瘤作用具體機制的研究尚不深入，并且其對膽囊癌作用的研究相對較少。因此，本研究從體內和體外觀察華蟾素對膽囊癌細胞的抑制作用，及體內對荷瘤裸鼠血清IL-6、TNF-α和sVCAM-1含量的影響，以探討其抗膽囊癌的作用及作用機制，為臨床應用提供藥理學基礎。

1 材料、實驗動物和儀器

人膽囊癌QBC939細胞由華中科技大學同濟醫學院提供；SPF級BALB/C-nu裸鼠，體重16～20 g，購于中國醫學科學院上海實驗動物繁殖中心，按SPF級要求管理；華蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司，批號：1204191)；5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司，批號：1111031)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；RPMI 1640培養粉(Gibco公司)；MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)；裸鼠細胞因子酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海森雄科技有限公司)；ELx800型酶聯免疫檢測儀(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 細胞培養 將膽囊癌QBC939細胞培養在含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的RPMI-1640培養基中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，用胰蛋白酶消化后按1∶3的比例傳代，每3天傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗研究。

2.2 MTT法檢測華蟾素對人膽囊癌細胞生長的抑制作用 取處于對數生長期的人膽囊癌QBC939細胞，按常規消化和洗滌后制成密度為1×105/mL的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。將溶解于1640培養液的華蟾素注射液分別加入96孔板中，使最終每組含華蟾素濃度分別為10、20、40、80、160、320 μg/mL，每組6個復孔，另設空白對照組。置培養箱培養后分別于24、48、72 h 3個時相各取出一塊96孔板，先在倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化，再進行MTT比色實驗：每次于實驗結束前從各孔中吸出100 μL上清棄去，再加入MTT 10 μL(終濃度為5 mg/mL)，繼續培養4 h后，加入DMSO 100 μL/孔，振蕩5 min，使結晶物充分溶解，用酶標儀于波長570 nm處測定各孔吸光度值(A)[5]。按照公式計算不同濃度的華蟾素注射液對QBC939細胞生長的抑制率：抑制率(%)=(陰性對照孔平均A值-藥物孔平均A值)/陰性對照孔平均A值×100%，并以劑量和抑制率繪制生長曲線。

2.3 制備模型、分組及給藥 取處于對數生長期的人膽囊癌QBC939細胞制成1×107/mL細胞懸液。在無菌條件下，將細胞懸液接種于BALB/C-nu裸鼠右腋皮下，每鼠接種0.2 mL，約3周待腫瘤生長至直徑約1 cm左右，以無菌技術取出皮下移植瘤。去除包膜和壞死灶，剪成約1 mm瘤塊植入裸鼠的右腋皮下，5～7 d待成瘤后將荷瘤裸鼠隨機分為陰性對照組、5-Fu陽性對照組(25 mg/kg)以及華蟾素注射液(25、50、100 mg/kg)3個劑量組，每組10只。正常組每日給予生理鹽水灌胃，陽性對照組和華蟾素組均采用腹腔注射的方式給藥，每次0.2 mL，皆連續給藥12 d。

2.4 檢測裸鼠一般狀況及進食量 給藥期間每日觀察裸鼠的活動情況、營養狀況和腫瘤生長情況等，并于給藥第2天和第9天晚上8∶00分別稱取各組飼料的質量W1，次日早晨8∶00稱取各組剩余飼料的質量W2，計算裸鼠進食量W=W1-W2。

2.5 檢測抑瘤率 取血后，脫頸椎處死裸鼠，剝取瘤塊，剔除其他組織后分析天平稱取瘤重量。計算各組平均瘤塊重量及抑瘤率。腫瘤抑制率(%)=[1-(治療組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)]×100%。

2.6 檢測血清IL-6、TNF-α和sVCAM-1水平 處死裸鼠前，眼眶靜脈叢采血，離心取上清分裝于EP管中。按照檢測試劑盒說明書采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測TNF-α的含量。建立標準曲線：設標準孔8孔，每孔加入樣品稀釋液100 μL，第1孔加標準品100 μL，混勻后吸出100 μL移至第2孔。如此反復做對倍稀釋至第7孔，最后，從第7孔吸出100 μL棄去，第8孔為空白對照。待測樣品孔加入裸鼠血清100 μL，將板置37 ℃反應120 min。用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，用吸水紙拍干。每孔加入第一抗體工作液100 μL，使充分混勻后置37 ℃反應60 min。用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，加入酶標抗體工作液100 μL，37 ℃反應60 min，洗板同前。加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應5～10 min，再加入50 μL終止液混勻，酶聯免疫檢測儀于490 nm處測吸光度，繪制標準曲線，并計算TNF-α含量。本實驗OD值的高低和細胞因子表達成正比。同法檢測并計算IL-6和sVCAM-1的含量。

3 結果

3.1 細胞形態學觀察結果 倒置顯微鏡下觀察可見對照組細胞生長良好，細胞呈圓形，形態均一，細胞間連接緊密。經過不同濃度華蟾素作用后的細胞出現皺縮等形態學改變，且隨著藥物濃度的增加，細胞密度逐漸減少，隨著作用時間的延長，上述變化更加明顯。結果見圖1。

3.2 對QBC939細胞生長的抑制作用 MTT實驗結果顯示，不同濃度的華蟾素注射液體外均可抑制QBC939細胞的增殖，各藥物濃度組細胞生長抑制率與同時間點對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，且隨作用時間的延長，與同濃度組比較抑制率上升，因此，可見華蟾素注射液體外對QBC939細胞的生長具有抑制作用，這種抑制作用具有濃度和時間依賴性。見圖2。

圖1 華蟾素注射液對QBC939細胞生長狀況的影響

3.3 對荷瘤裸鼠一般狀況及進食量的影響 給藥期間觀察荷瘤裸鼠的一般狀況，發現荷瘤對照組裸鼠腫瘤增大，并逐漸表現出狀態欠佳、懶惰、喜靜、活動遲緩等癥狀，給藥組裸鼠腫瘤增大趨勢不及荷瘤對照組，行動同樣遲緩，但活動量稍多于荷瘤對照組。實驗結果顯示，荷瘤對照組裸鼠的進食量減少，9 d時更明顯；華蟾素腹腔注射給藥皆可不同程度增加荷瘤裸鼠進食量，9 d時更加明顯，其中高劑量組增加量最多，提示華蟾素可改善裸鼠一般狀況和進食量，并具有濃度依賴性，與模型組相比差異無統計學意義。具體結果見表1。

圖2 華蟾素注射液體外對QBC939細胞增殖的抑制作用

表1 華蟾素注射液對荷瘤裸鼠進食量的影響(n=10)

3.4 對荷瘤裸鼠瘤質量的影響 實驗結果顯示，給藥12 d后，5-Fu(25 mg/kg)可明顯抑制荷瘤裸鼠的瘤質量的增長，與模型組比較具有顯著差異(P<0.001)；華蟾素3個劑量組(25、50、100 mg/kg)皆可不同程度抑制荷瘤裸鼠瘤質量的增加，與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.01，P<0.05)，隨著劑量的增加，抑瘤率也增大。見表2。

表2 華蟾素注射液對荷瘤裸鼠瘤質量的影響

3.5 對荷瘤裸鼠血清IL-6、TNF-α和sVCAM-1含量的影響 與模型組比較，5-Fu(25 mg/kg)能夠提高荷瘤裸鼠血清TNF-α含量(P<0.05)，降低sVCAM-1含量(P<0.01)；高、中劑量的華蟾素組裸鼠血清IL-6水平下降(P<0.05)，TNF-α含量升高(P<0.05)；三個劑量組的華蟾素均能降低裸鼠血清sVCAM-1含量(P<0.01，P<0.05)。見表3。

表3 華蟾素注射液對荷瘤裸鼠血清IL-6、sVCAM-1和TNF-α含量的影響

4 討論

膽囊癌是膽道系統常見的惡性腫瘤，占消化道惡性腫瘤發病率的第5位，膽囊癌發病隱匿，惡性程度高，早期無特殊的臨床癥狀。雖然膽囊癌的手術治療經歷了百年多的歷史，但國內外資料表明仍未取得突破性進展，療效不盡人意，目前在確診膽囊癌的患者中僅有約30%能獲得根治性切除[6]，除了手術以外主要的治療方法是放療和化療。由于缺乏特異的癥狀和體征，膽囊癌早期診斷率低，就診的晚期病例難以根治、預后差。目前的常規化療藥物對膽囊癌的治療效果較差，不能提高膽囊癌患者的生活質量[7]。因此，國內外許多學者試圖從天然藥物中尋找能有效抑制惡性腫瘤細胞增殖的藥物或其活性成分用于治療膽囊癌。

蟾蜍入藥早在唐宋時代就有記載，臨床常用于惡瘡、腫瘤、水腫等。華蟾素注射液是以傳統中藥材中華大蟾蜍皮為主要原料制成的一種水溶性制劑，目前已經廣泛應用于臨床[8]。現代藥理學研究表明其有一定的抗腫瘤作用，大量的臨床和實驗研究證實華蟾素注射液是安全、有效的抗腫瘤制劑[9-10]。體內外實驗研究表明，華蟾素及其活性成分蟾毒靈、脂蟾蜍配基等對白血病、胰腺癌、子宮內膜癌等惡性腫瘤均有一定的作用[11-12]，其選擇性作用較強，對正常組織和細胞無殺傷作用，在抗腫瘤治療方面有巨大潛力，但是關于其作用于膽囊癌細胞的基礎研究報道尚少。

裸鼠異種移植瘤模型是人們進行腫瘤實驗性治療廣泛采用的研究手段。本研究采用MTT法檢測華蟾素注射液體外對人膽囊癌QBC939細胞生長的影響，以及體內對建立的QBC939細胞裸鼠異種移植瘤行腹腔注射方式給藥，實驗發現，華蟾素體內外均可有效殺傷人膽囊癌細胞QBC939，明顯抑制其增殖，與對照組比較差異有統計學意義，濃度越高，抑制作用越強，且隨著作用時間的延長，抑制作用也增強；倒置顯微鏡下觀察還發現，經華蟾素處理過的腫瘤細胞出現皺縮等形態學改變，且隨著濃度和時間的增加，細胞密度逐漸減少。提示華蟾素注射液具有明顯的抗膽囊癌活性，且作用呈現劑量依賴性。

IL-6是一種多功能生物活性多肽，可由巨噬細胞、成纖維細胞等分泌，也可由腫瘤細胞旁分泌和自分泌產生。IL-6在肝癌、胃癌、結腸癌和乳腺癌等多種惡性疾病中高表達，促進癌細胞的侵襲和轉移，其高表達往往提示腫瘤患者一般情況較差，預后不良[13-14]。TNF-α屬腫瘤壞死因子家族，由單核-巨噬細胞、NK細胞、T細胞分泌，它對腫瘤細胞有直接殺傷作用而對正常細胞無明顯毒性，在體內也可通過對腫瘤血管的促凝作用，使腫瘤缺血壞死，還可誘導許多不同來源腫瘤細胞凋亡，是迄今為止所發現的直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子之一，血中TNF-α含量可反映機體抗腫瘤免疫狀態[15-16]。本實驗發現，華蟾素能抑制裸鼠血清IL-6的表達，促進TNF-α的表達，作用具有劑量依賴性，與模型組相比，皆具有顯著性差異(P<0.01)，且具有劑量依賴性，這對防癌、抗癌以及抗腫瘤轉移皆具有重要意義。

sVCAM-1是黏附分子免疫球蛋白超基因家族的成員，可參與多種生理、病理反應。近年來研究發現，sVCAM-1在多種腫瘤中存在異常表達，并與腫瘤的惡性臨床表現有一定關系[17]。在早期或亞臨床期惡性腫瘤患者中，血清sVCAM-1水平異常升高，而將腫瘤進行手術切除以后，sVCAM-1水平可迅速下降[18]。本實驗發現，華蟾素各濃度均可以抑制裸鼠血清sVCAM-1的表達，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)，但是sVCAM-1水平與華蟾素劑量之間的關系不明顯，說明華蟾素對血清sVCAM-1的影響無劑量依賴性，還需進一步探討。

發現新型抗腫瘤活性高、毒副作用小的抗腫瘤藥物一直是腫瘤治療領域需要解決的重要任務。本實驗表明，華蟾素體內外均可抑制膽囊癌的生長，裸鼠體內抑瘤作用機制可能與裸鼠血清IL-6和sVCAM-1等細胞因子水平下調及TNF-α水平上調有關，這為臨床應用華蟾素治療膽囊癌提供了一定的理論依據，但是機體腫瘤的形成和發展過程極其復雜，在治療中僅依靠華蟾素難以取得有效的成果，若將其與放化療聯合使用，能否有效控制膽囊癌生長，減少耐藥性，值得進一步研究。

參考文獻：

[1] 吳旭,高波,楊健,等.華蟾素注射液多肽成分體外抗腫瘤活性研究[J].藥學學報,2012,47(6):822-826.

[2] 齊芳華,李安源,趙林,等.華蟾素誘導人肝癌細胞株HepG2凋亡及其作用機制[J].藥學學報,2010,45(3):318-323.

[3] 朱曉燕,徐立濤,劉魯明,等.華蟾素對人胰腺癌細胞BxPC3細胞增殖和細胞周期的影響[J].老年醫學與保健,2013,19(1):41-43.

[4] 齊芳華,李安源,趙林華,等.蟾素誘導人肝癌細胞株HepG2凋亡及其作用機制[J].藥學學報,2010,45(3):318-323.

[5] 葉華,鄭學寶,李立,等.5F對肝癌細胞毒性、細胞凋亡及細胞周期的影響[J].時珍國醫國藥,2012,23(6):1342-1344.

[6] Marsh Rde W,Alonzo M,Bajaj S,et al.Comprehensive review of the diagnosis and treatment of biliary tract cancer 2012.Part I:diagnosis-clinical staging and pathology[J].J Surg Oncol,2012,106(3):332-328.

[7] 石景森,孫學軍,鄭見寶.原發性膽囊癌的臨床診治現狀與對策[J].外科理論與實踐,2013,18(2):101-103.

[8] 李建昌,柳建軍,凌生濤.華蟾素對SD大鼠膀胱腫瘤的抑制作用[J].第三軍醫大學學報,2012,34(8):726-728.

[9] Qi F,Li A,Inagaki Y,et al.Induction of apoptosis by cinobufacini preparation through mitochondria-and Fasmediated caspase-dependent pathways in human hepatocellular carcinoma cells[J].Food Chem Toxicol,2012,50(2):295-302.

[10]Wang L,Raju U,Milas L,et al.Huachansu,containing cardiac glycosides,enhances radiosensitivity of human lung cancer cells[J].Anticancer Res,2011,31(6):2141-2148.

[11]劉偉.華蟾素誘導L1210細胞凋亡及作用機制的研究[J].中國醫學創新,2012,9(24):16-17.

[12]朱曉燕,盂志強,陳震,等.華蟾素不同組分對荷人胰腺癌SW1990裸小鼠的抑瘤作用[J].上海中醫藥雜志,2009,43(11):69-71.

[13]Talar-Wojnarowska R,Gasiorowska A,Smolarz B,et al.Clinical significance of interleukin-6 gene polymorphism and IL-6 serllm level in pancreatic adenocarcinoma and chronic pancreatitis[J].Dig Dis Sci,2009,54(3):683.

[14]Paradkar PH,Agashe SV,JoshiJV,et al.Serum IL-6 and micrometry of pap smears in women with cervical low-grade intraepithelial lesions[J].Asian Pac J Cancer Prev,2010,11(4):989-992.

[15]Kruglov AA,Kuchmiy A,Grivennikov SI,et al.Physiological functions of tumor necrosis factor and the consequences of its pathologic overexpression or blockade:Mouse models[J].Cytokine Growth Factor Rev,2008,19(3-4):231-244.

[16]陳學彰,田華琴,黃志慶,等.肺積方對Lewis肺癌小鼠抑瘤率及EGFR、TNF-α表達的實驗研究[J].中西醫結合研究,2013,5(1):17-20.

[17]歐陽華強,謝廣茹,潘戰宇,等.華蟾素對人胰腺癌CFPAC-l移植瘤裸鼠血清IL-6,IL-8及sVCAM-1表達的影響[J].中國中藥雜志,2011,36(19):2731-2733.

[18]Mantur M,Snarska J,Koper O,et al.Serum sICAM,sVCAM and sE-selectin levels in colorectal cancer patients[J].Folia Histochem Cytobiol,2009,47(4):621.