甲磺酸伊馬替尼增加順鉑對耐藥卵巢癌細胞作用的研究

張 闊，陳 燕

0 引言

卵巢癌是死亡率最高的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，其中上皮性癌占卵巢癌的90%，因為卵巢深居盆腔，常因發(fā)現(xiàn)晚、播散快而嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。目前，卵巢癌的治療方案為手術(shù)聯(lián)合化療。腫瘤減滅術(shù)后和不能耐受手術(shù)的患者都需要通過化療來提高患者的生存率，鉑類的初始化療對絕大部分患者有效，但這些患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和耐藥，因此，對化療藥物耐藥成為治療中最棘手的問題。以鉑類為代表的臨床一線化療藥有消化道反應(yīng)和腎毒性，并且隨著濃度的增大，毒性反應(yīng)更加明顯。因此，尋找治療效果好，毒副作用小，并能提高卵巢癌對化療藥物敏感性的藥物和治療方案迫在眉睫[1]。分子靶向藥物是利用腫瘤細胞與正常細胞之間分子生物學(xué)上的差異(包括基因、酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等不同特性)，抑制腫瘤細胞增殖，最后使其死亡。近年研究發(fā)現(xiàn)，分子靶向治療藥物與傳統(tǒng)藥物相比，毒副作用小，無須最大耐受劑量即可獲得較好的臨床療效，也可以為一些耐藥腫瘤的治療提供新的方案，受到廣泛關(guān)注。甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)是分子靶向藥物的一種，屬于酪氨酸激酶受體抑制劑。有研究表明，該藥物特異性靶向3種受體，分別是 Bcr-Abl酪氨酸激酶、血小板源性生長因子受體(PDGFR)、干細胞因子(c-Kit)，可以通過阻止酪氨酸激酶受體自身的磷酸化，影響細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，破壞細胞周期進程，從而影響腫瘤細胞的增殖、分化與凋亡[2]。本研究以其中的耐藥卵巢癌細胞系SKOV3/DDP為研究對象，從細胞增殖、凋亡等方面探討甲磺酸伊馬替尼對卵巢癌耐藥細胞體外培養(yǎng)的影響，以及其對細胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SKOV3細胞株(人卵巢漿液性囊腺癌細胞株)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供；甲磺酸伊馬替尼，大連美侖生物技術(shù)有限公司；順鉑(DDP)，山東羅欣藥業(yè)有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、RNA酶、胰蛋白酶，Sigma公司；PRMI-1640培養(yǎng)基，GIBCO公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品公司；AnnexinV-EGFP 細胞凋亡檢測試劑盒，聯(lián)科生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SKOV3細胞株在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2混合氣體的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞換液為24～48 h，待細胞鋪滿瓶底80%～90%時，0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期細胞進行實驗，采用順鉑中等濃度、間歇作用方法建立SKOV3/DDP細胞株。

1.2.2 MTT法檢測不同濃度的甲磺酸伊馬替尼、DDP單用藥以及聯(lián)合用藥對人卵巢癌耐順鉑細胞株SKOV3/DDP的增殖抑制情況 MTT法測定：取對數(shù)生長期的SKOV3/DDP細胞，胰酶進行消化，制成單細胞懸液，進行細胞計數(shù)，按照母孔1×104個/200 μL的細胞數(shù)接種于96孔板中的細胞分別培養(yǎng)24 h后，倒置像差顯微鏡下觀察，選擇細胞貼壁生長狀態(tài)良好的進行試驗。藥物處理組根據(jù)藥物不同分為以下3組：甲磺酸伊馬替尼組，終濃度分為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L；DDP組，終濃度為5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 mg/L；聯(lián)合組，終濃度甲磺酸伊馬替尼5.0 μmol/L分別與DDP 5.0、10.0、20.0 mg/L聯(lián)用，兩藥合用的比例為1∶1。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)。每個濃度設(shè)4個平行復(fù)孔，設(shè)調(diào)零孔為空白對照組(OD值為0)。甲磺酸伊馬替尼單藥作用24、48、72 h不同的時間點，DDP單藥組以及聯(lián)合用藥組作用48 h。終止培養(yǎng)，避光操作下，每孔加入配好的5 g/L的MTT溶液20 μL，37 ℃孵箱內(nèi)避光孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基終止培養(yǎng)。每孔加入DMSO 150 μL，室溫下震蕩器低速震蕩15 min。在酶標(biāo)儀上選擇波長為595 nm，測定細胞的吸光度(OD)值，實驗重復(fù)3次。

計算出SKOV3/DDP的耐藥指數(shù)以及甲磺酸伊馬替尼、DDP單藥及聯(lián)合用藥對SKOV3/DDP細胞株的生長抑制率及IC50值、DDP的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。公式：(1)細胞生長抑制率=[1-(用藥組OD值-調(diào)零孔OD值)/(無藥組OD值-調(diào)零孔OD值)]×100%；(2)IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]；(3)耐藥指數(shù)=SKOV3/DDP的IC50/SKOV3的IC50。

1.2.3 流式細胞儀測定細胞凋亡率 取對數(shù)生長期的SKOV3/DDP細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2培育箱中培養(yǎng)24 h后換液。實驗組分3組：單用DDP組，濃度5 mg/L；單用甲磺酸伊馬替尼組，濃度5 μmol/L；聯(lián)合用藥組終濃度DDP 10 mg/L和甲磺酸伊馬替尼5 μmol/L；給藥24 h后收集細胞，離心、PBS洗滌，加入結(jié)合緩沖液(Binding buffer)懸浮細胞，加入annexinV-FITC 5 μL輕輕混勻，室溫避光孵育，10 min后1 000 r離心5 min，棄上清，加入annexinV-FITC的結(jié)合緩沖液190 μL輕輕重懸細胞，加入10 μL碘化丙啶(PI)，冰浴避光放置。流式細胞儀檢測細胞早期凋亡情況。

2 實驗結(jié)果

2.1 通過誘導(dǎo)耐藥建立SKOV3/DDP 細胞株，計算出DDP對于SKOV3/DDP細胞及SKOV3細胞的IC50值分別為(39.57±0.98)mg/L和(9.81±0.07)mg/L，其耐藥指數(shù)約為4.03。

2.2 采用MTT法檢測甲磺酸伊馬替尼、DDP單藥及聯(lián)合用藥時對SKOV3/DDP細胞生長的影響

2.2.1 MTT法檢測出不同藥物濃度的甲磺酸伊馬替尼作用于SKOV3/DDP細胞呈現(xiàn)出不同程度的細胞生長抑制作用，隨藥物濃度的增高、作用時間的延長對細胞的增殖抑制作用增強，甲磺酸伊馬替尼在5.0 μmol/L作用48 h細胞生長抑制率約為30%，故選用此藥物濃度組作為后續(xù)實驗的藥物濃度。

表1 甲磺酸伊馬替尼作用于SKOV3/DDP細胞不同作用時間生長抑制率變化

2.2.2 甲磺酸伊馬替尼與DDP兩藥聯(lián)合應(yīng)用對SKOV3/DDP細胞增殖的影響 依據(jù)DDP單藥對SKOV3/DDP作用的結(jié)果，選擇對細胞生長抑制率小于50%的3個DDP濃度：5、10、20 mg/L，依據(jù)表1選擇甲磺酸伊馬替尼劑量濃度為5.0 μmol/L，二者聯(lián)合作用于SKOV3/DDP細胞48 h，計算生長抑制率。由表2可見，兩藥聯(lián)合用藥組對細胞生長抑制率分別為(38.63±1.31)%、(51.55±1.20)%、(66.54±1.23)%，明顯高于DDP單用藥組的(8.30±0.85)%、(16.68±1.69)%、(30.83±1.78)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此計算出兩藥合用后的IC50=39.57±0.13，顯著高于單用順鉑的9.57±0.13，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，DDP的藥物敏感性增加4.13倍，見表3。

表2 甲磺酸伊馬替尼與不同濃度DDP聯(lián)合作用于SKOV3/DDP細胞的生長抑制率

表3 甲磺酸伊馬替尼與DDP聯(lián)合對SKOV3/DDP細胞的影響

2.3 流式細胞儀檢測甲磺酸伊馬替尼、DDP單獨及聯(lián)合應(yīng)用對SKOV3/DDP凋亡的影響 由表4可以看出，對照組、DDP單用藥組、甲磺酸伊馬替尼單用藥組的早期凋亡率分別為0.63%、1.25%、4.57%，各單獨用藥組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合用藥組的凋亡率為12.31%，明顯較其他單獨用藥組增高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明甲磺酸伊馬替尼可通過誘導(dǎo)耐藥細胞的凋亡從而增強對DDP的敏感性。

表4 甲磺酸伊馬替尼、DDP單獨及聯(lián)合應(yīng)用對細胞凋亡的影響

3 討論

卵巢癌在女性生殖道腫瘤的發(fā)病率中居第3位，但死亡率最高，傳統(tǒng)的治療方法為在腫瘤細胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上聯(lián)合藥物(鉑類和紫杉醇為主)化療，但最終大多患者會復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)后存活時間一般少于3 年[3]。一方面由于70%的患者在確診時已經(jīng)處于晚期，另一方面由于化療耐藥，致使預(yù)后更差。近年來發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者常常伴有外周血小板增多，而且血小板增多預(yù)示著不良結(jié)局[4]，提示抗血小板治療可能是一項有效的治療措施。血小板增多導(dǎo)致血小板衍生因子(PDGF)釋放增多。而PDGF 受體(PDGFR)是腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的重要因素，其過表達與腫瘤的耐藥有關(guān)[5]。首先，卵巢腫瘤存在一種旁分泌通路，能增加PDGF釋放[6]，并且發(fā)現(xiàn)卵巢癌可檢測到PDGFR的高水平表達[7]。這種旁分泌方式PDGFR的表達以及表達量的高低是一些腫瘤細胞增殖的限速步驟[8]，PDGFR表達越高，腫瘤細胞增殖越快。并且PDGF和PDGFR的結(jié)合及信號通路的激活可增加腫瘤基質(zhì)的組織間液體壓(Interstitial fluid pressure，IFP)[9]，從而阻礙抗腫瘤藥物有效運輸?shù)侥[瘤，減少了腫瘤組織對藥物的攝取，從而使腫瘤細胞逃逸被殺或死亡[10]，導(dǎo)致腫瘤的耐藥。PDGFR抑制劑可正常化IFP，從而增加抗腫瘤藥物的療效。

分子靶向藥物—甲磺酸伊馬替尼是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，可以靶向PDGFR，此藥以細胞信號傳導(dǎo)的特異分子為靶點，通過競爭結(jié)合ATP位點，特異地阻止酪氨酸激酶受體自身磷酸化，影響腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡[11]。甲磺酸伊馬替尼開始用于治療慢性髓性白血病(CML)，后來用于胃腸道腫瘤的治療，效果顯著[12]。近幾年應(yīng)用于小細胞肺癌、皮膚癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌等方面的研究較多[13]，國外學(xué)者在卵巢癌方面也進行了較多的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對至少表達1種伊馬替尼靶向受體c-kit、c-abl、PDGFR的鉑類耐藥和紫杉醇耐藥的復(fù)發(fā)卵巢癌患者單一應(yīng)用伊馬替尼治療，這些患者都能較好地耐受伊馬替尼，但并沒有明顯的臨床療效[14-15]。本實驗將甲磺酸伊馬替尼及順鉑聯(lián)用，觀察其對卵巢癌耐藥細胞系SKOV3/DDP的增殖抑制作用、誘導(dǎo)凋亡作用以及對DDP耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。研究表明，甲磺酸伊馬替尼單獨應(yīng)用，增殖抑制率隨著各自濃度及時間的增加而增加，各組與對照組之間差異顯著；與DDP聯(lián)合應(yīng)用，各組與單獨用藥組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且甲磺酸伊馬替尼可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞對DDP耐藥。流式細胞儀檢測細胞凋亡率結(jié)果顯示：兩藥聯(lián)合組的細胞凋亡率明顯高于單藥組，說明甲磺酸伊馬替尼與順鉑具有協(xié)同作用，能促進細胞凋亡，增加對DDP的敏感性。

綜上所述，本實驗采用聯(lián)合用藥的方法進行實驗，發(fā)現(xiàn)PDGFR抑制劑—甲磺酸伊馬替尼作為新一代抗腫瘤藥，能有效抑制卵巢癌細胞的增殖，同時能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對順鉑的耐藥性。為臨床卵巢癌的化療提供了新的參考方法。甲磺酸伊馬替尼還可以靶向c-kit、c-abl兩種受體，通過除PDGFR以外的其他途徑發(fā)揮作用，有待于其他實驗進行進一步的探索。

參考文獻：

[1] 溫灝,吳小華.復(fù)發(fā)性卵巢癌研究現(xiàn)狀及治療決策[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2012,28(3):192-196.

[2] 孫宇輝,王蕾,鄭建華,等.格列衛(wèi)對卵巢癌細胞COC1增殖及血管形成的影響[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2007,23(12):932-934.

[3] 邱彩虹,邱麗華.復(fù)發(fā)性卵巢癌治療新進展[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展,2012,21(1):64-66.

[4] Raungkaewmanee S,Tangjitgamol S,Manusirivithaya S,et al.Platelet to lymphocytera-tio as a prognostic factor for epithelial ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,2012,23(4):265-273.

[5] Burger RA.Overview of anti-argiogenic agents in development for ovarian cancer[J].Gynecologic Oncology,2011,121(1):230-238.

[6] Madsen CV,Steffensen KD,Olsen DA,et al.Serum platelet-derived growth factor and fibroblast growth factor in patients with benign and malignant ovarian tumors[J].Anticancer Reader,2012,32(9):3817-3825.

[7] 易村犍,馬丁.C-Kit、PDGFRA的表達與卵巢漿液性癌順鉑耐藥的臨床研究[J].腫瘤防治研究,2008,35(11):805-807.

[8] 陳旭升,孫丹.PDGF和PDGFR與腫瘤的關(guān)系及其靶向治療研究進展[J].中國腫瘤臨床,2012,39(15):1134-1137.

[9] 李代洪,艾俊濤,謝欣,等.血小板衍生生長因子受體(PDGFR)抑制劑的研究進展[J].腫瘤藥學(xué),2013,3(1):2-6.

[10]趙亞娟,富建華,孫梅.谷氨酰胺影響膿毒癥大鼠腦內(nèi)PDGF及其受體表達的研究[J].中國當(dāng)代兒科雜志,2010,12(12):967-971.

[11]鄭方英,魏永強,孫海燕,等.伊馬替尼治療慢性嗜酸性粒細胞白血病1例并文獻復(fù)習(xí)[J].中華內(nèi)科雜志,2010,49(11):974-976.

[12]丁倩倩,陳勤奮.甲磺酸伊馬替尼的臨床應(yīng)用[J].上海醫(yī)藥,2013,34(3):5-9.

[13]宋耕,軒菡,王年飛,等.甲磺酸伊馬替尼的臨床應(yīng)用研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2011,5(24):7348-7350.

[14]Schilder RJ,Sill MW,Lee RB,et al.PhaseⅡ evaluation of imatinib mesylate in the treatment of recurrent or persistent epithelial ovarian or primary peritoneal carcinoma:a Gynecologic Oncology Group Study[J].J Clin Oncol,2008,26(20):3418-3425.

[15]Safra T,Andreopoulou E,Levinson B,et al.Weekly paclitaxel with intermittent imatinib mesylate(Gleevec):tolerance and activity in Recurrent epithelial ovarian cancer[J].Anticancer Res,2010,30(1):3243-3247.