HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定復(fù)方三七漱口液中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1的含量

王 瑩，賀文娟，顧 宜，成黎霏，王曉娟

0 引言

復(fù)方三七漱口液收載于《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》2002年版[1]。由三七和醋酸氯己定組成，具有散瘀止血、消腫定痛的功效，用于口腔炎、牙周炎、牙周腫痛、咽喉痛、牙齦出血等常見病的防治。三七中主要含三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1[2]，原標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)三七中人參皂苷Rb1進(jìn)行了薄層鑒別，未對(duì)三七中的專屬性成分三七皂苷R1及人參皂苷Rg1進(jìn)行鑒別和含量測(cè)定，不能有效控制該制劑的質(zhì)量。目前文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1的測(cè)定多采用HPLC-UV法[3-6]，亦有采用HPLC-ELSD法[7-9]。因皂苷類成分的紫外吸收均為末端吸收，使用HPLC-UV法時(shí)基線易漂移，且靈敏度低，故本試驗(yàn)選用HPLC-ELSD法測(cè)定復(fù)方三七漱口液中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津制作所)；DL-720超聲儀(浙江石浦海天電子儀器廠)；BT125D分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 復(fù)方三七漱口液(200 mL/瓶，批號(hào)：130723、130804、130810，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科)；對(duì)照品三七皂苷R1(批號(hào)：110745-200617，純度大于98%)，人參皂苷Rg1(批號(hào)：110703-201027，純度為96.3%)，人參皂苷Rb1(批號(hào)：110704-201223，純度為95.9%)，均購自于中國藥品生物制品檢定所；乙腈、甲醇[色譜純，購于霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司]；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別[1-2,11-12]

2.1.1 供試品溶液 取10 mL復(fù)方三七漱口液，加10 mL飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇層，加3倍正丁醇飽和的水，放置分層，取正丁醇層，水浴蒸干，加2 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液 取0.5 g三七粉，加水5滴，再加水飽和的正丁醇5 mL，振搖10 min，放2 h，取上清液，加3倍正丁醇飽和的水，放置分層，取正丁醇層，水浴蒸干，加1 mL甲醇溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液 稱取適量三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，分別制成0.5 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液 按處方比例，制成不含三七提取液的陰性藥，按“2.1.1”項(xiàng)下制備，作為陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 薄層展開 照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取以上溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)置于10 ℃以下，放置12 h，取下層溶液作為層析液，展開，預(yù)飽和30 min，展距10 cm，噴以10%硫酸乙醇，105 ℃烘至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1。

圖1 復(fù)方三七漱口液薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 溶液的配制 a.混合對(duì)照品溶液：精密稱取適量的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，分別制成每1 mL含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1分別為0.1 mg、0.4 mg和0.4 mg的溶液，即為混合對(duì)照品溶液。b.供試品溶液：取本品一瓶超聲20 min，精密量取5 mL，加甲醇稀釋溶解至10 mL，即得。c.陰性樣品溶液：按處方比例，制成不含三七提取液的陰性藥，按“供試品溶液”制備，即得。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：DIKMA Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水梯度洗脫；流速：1 mL/min；柱溫為30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度47 ℃，載氣流速1.5 L/min。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2.3 方法學(xué)考察 專屬性：分別精密吸取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，見圖2。結(jié)果顯示，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1與其他組分峰的分離度均大于1.5，陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)保留時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)色譜峰，表明陰性對(duì)照溶液無干擾，專屬性強(qiáng)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密吸取混合對(duì)照品溶液4、6、8、10、12、15 μL，注入液相色譜儀，以進(jìn)樣質(zhì)量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)、峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的線性關(guān)系

穩(wěn)定性：精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8、12 h按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為1.96%、1.43%和1.97%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

精密度：分別精密吸取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為1.75%、1.83%和1.88%，表明精密度良好。

重復(fù)性：取同一批號(hào)(130723)的復(fù)方三七漱口液，按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備平行制備供試品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的RSD分別為1.80%、1.77%和2.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

圖2 高效液相色譜圖

加樣回收率：精密量取已知含量的樣品(批號(hào)：130723，三七皂苷R10.06 mg/mL，人參皂苷Rg10.25 mg/mL，人參皂苷Rb10.20 mg/mL)5 mL，共9份，分別精密加入三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備制成低、中、高三種濃度，每組3份，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2.4 樣品含量測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)(130723、130804、130810)的復(fù)方三七漱口液，分別按照“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄峰面積，按照外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量，見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/mL)

3 討論

在預(yù)試驗(yàn)階段，參照中國藥典2010版一部中三七項(xiàng)下皂苷類化合物的測(cè)定方法，采用HPLC-UV法對(duì)復(fù)方三七漱口液中的三七皂苷R1，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基線漂移嚴(yán)重，各指標(biāo)成分分離較差；而蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)是一種質(zhì)量型檢測(cè)器，其響應(yīng)與被測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量相關(guān)而不依賴于被測(cè)物的光學(xué)性質(zhì)，所以在選用ELSD作為檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，基線平穩(wěn)，色譜峰峰形較好，分離度好。

復(fù)方三七漱口液中三七皂苷R1含量較少，參考2010版中國藥典中三七藥材的處理方法，對(duì)復(fù)方三七漱口液用飽和正丁醇萃取3次，使三七皂苷R1更多地被提取，使TLC鑒別現(xiàn)象更明顯；所建立的HPLC-ELSD法避免了HPLC-UV法基線漂移、分離度差的問題，較其他的HPLC-ELSD法所用分析時(shí)間更短[8-10]。通過運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-ELSD法對(duì)三批制劑中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠，可更好地控制復(fù)方三七漱口液的質(zhì)量

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