活血定痛合劑中丹參素和原兒茶醛的含量測定

李全斌，張昌文，吳建萍，錢洪波，李紀元

0 引言

活血定痛合劑(HXDTM)為醫院協定處方制備的中藥復方醫院制劑，由丹參、赤芍、當歸、川芎、紅花、生地、桃仁、蘇木、陳皮、枳殼、瓜蔞等十多味中藥制成，前期藥理學實驗初步證實了HXDTM具有良好的抗炎、鎮痛及改善微循環作用[1-5]。該制劑中諸藥合用,可主治因氣滯血瘀之痛癥、跌打損傷、骨折腫痛等，具有活血化瘀、消腫止痛之功效，療效確切。丹參作為我國傳統的中藥材之一，其有效成分復雜，組方中丹參的水溶性酚酸類化合物(均具有鄰二酚羥基苯甲醛的結構)，如丹參素、原兒茶醛和丹酚酸B等，以及脂溶性的二萜醌類化合物，如丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等，在丹參的生物學活性方面占有重要的地位，因此，可用于丹參制劑的質量控制與評價[6]。

活血定痛合劑采用水提工藝制備，用薄層色譜對HXDTM中的當歸、川芎、紅花、赤芍、丹參等進行定性鑒別，通過在室溫下留樣試驗考察該制劑的外觀、性狀、鑒別以及微生物限度等項目，表明該制劑質量穩定[7]。但該制劑中脂溶性成分丹參酮ⅡA含量很低，難以檢測，為了進一步有效地控制活血定痛合劑的質量，確保臨床用藥安全、有效，本實驗以丹參中的水溶性活性成分丹參素鈉和原兒茶醛作為含量測定的考察指標，用高效液相色譜法測定活血定痛合劑中二者含量，方法簡便準確，結果滿意，為控制活血定痛合劑的質量提供了可靠實驗依據，現將結果報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilentl100高效液相色譜儀(美國安捷倫)，Agilent紫外檢測器，Agilent色譜化學工作站，Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，XS-104微量分析天平(瑞士梅特勒公司)，摩爾純水機，UV-2201(日本島津)，Sartorius CP225D分析天平(德國Sartorius公司)。

1.2 試藥 丹參素鈉和原兒茶醛對照品(中國藥品生物制品檢定所，含量測定用，批號：110855-200507、l10810-200506)，HXDTM及陰性對照品(自制，由華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院制劑室提供處方，規格:500 mL/瓶，批號：20120628、20120816和20121012)，甲醇(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)，冰醋酸(分析純，北京化工廠)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent公司；流動相:乙腈-0.5%冰醋酸(25∶75)；柱溫:35 ℃；檢測波長:280 nm流速:1.0 mL/min；進樣量:10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取丹參素鈉(經五氧化二磷減壓干燥24 h)對照品8.4 mg，置于25 mL量瓶中，用0.5%冰醋酸水溶液溶解并定容至刻度，制成質量濃度為0.336 g/L的丹參素鈉對照品儲備溶液。

精密稱取原兒茶醛(經五氧化二磷減壓干燥24 h)對照品3.2 mg，置于25 mL量瓶中，用0.5%冰醋酸水溶液溶解并定容至刻度，制成質量濃度為0.128 g/L的原兒茶醛對照品儲備溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取HXDTM 1 mL，置于10 mL量瓶中，用0.5%冰醋酸水溶液稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按HXDTM的處方及制備工藝制備不含丹參藥材的陰性樣品，按“2.2.1”項下方法制備，即得陰性對照溶液。

2.3 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.1”項下質量濃度為0.336 g/L丹參素鈉對照品儲備溶液5 mL和質量濃度為0.128 g/L的原兒茶醛對照品儲備溶液5 mL，置于10 mL的棕色量瓶中，制得含丹參素鈉168.00 μg/mL和原兒茶醛的質量濃度為64.00 μg/mL的混合溶液，取上述混合溶液5、2.5 mL置于10 mL的棕色量瓶中，用0.5%醋酸水溶液定容稀釋，可以制得含丹參素鈉42.00、84.00 μg/mL和原兒茶醛的質量濃度為16.00、32.00 μg/mL的混合溶液，如此操作可以制得含丹參素鈉5.25、10.50、21.00 μg/mL和原兒茶醛的質量濃度為2.00、4.00、8.00 μg/mL的系列混合溶液，在上述色譜條件下操作，進樣量為10 μL，以丹參素鈉、原兒茶醛峰面積(A)為縱坐標，以丹參素鈉、原兒茶醛質量濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，丹參素鈉與原兒茶醛的回歸方程分別為：A1=3.915×104C1-6.912×102，r=0.998 9；A2=5.453×105C2-6.569×103，r=0.999 3。

結果表明：丹參素鈉與原兒茶醛進樣量分別在5.25～168.00 μg/mL和2.00～64.00 μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.4 系統適應性試驗 按上述色譜條件下，取線性關系項下制備的混合對照品標準溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，設定進樣次序。記錄HPLC圖，在以上色譜條件下，丹參素和原兒茶醛與其他色譜峰能達到較好的分離，丹參素鈉保留時間約8.9 min，原兒茶醛保留時間為15.9 min；理論塔板數按丹參素計算不低于4 000，按原兒茶醛計算不低于5 000；陰性對照品溶液在丹參素和原兒茶醛吸收峰的位置上均無吸收峰，供試品溶液中丹參素鈉、原兒茶醛可達到基線分離，峰形對稱，陰性對照品溶液無干擾，基線穩定，方法可行。實驗結果見圖1。

2.5 精密度試驗 取線性關系項下的同一混合對照品溶液(含丹參素鈉42.00 μg/mL，原兒茶醛16.00 μg/mL)10μL，在擬定的色譜條件下重復進樣6次，記錄峰面積，計算得丹參素鈉和原兒茶醛的RSD(n=6)分別為1.06%和1.09%，結果表明該儀器精密度良好。

2.6 重現性試驗 取HXDTM(批號：20110216)適量，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下，重復進樣5次，記錄丹參素鈉和原兒茶醛的峰面積，計算得到RSD分別為0.92%和0.87%，結果表明該測定方法的重現性符合要求。

2.7 穩定性試驗 取HXDTM(批號：20110216)適量，室溫放置，按上述色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，測定峰面積，丹參素鈉和原兒茶醛的RSD(n=6)分別為1.62%和1.49%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

圖1 HXDTM的高效液相色譜圖

2.8 加樣回收率試驗 精密吸取已知丹參素鈉和原兒茶醛含量的HXDTM樣品(批號：20110221)9份，每份1 mL，按大約樣品含量的20%、40%、80%分別加入線性關系項下的丹參素鈉及原兒茶醛適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，進樣測定，計算加樣回收率，結果見表1，表明方法的回收率良好。

表1 回收率實驗結果(n=9)

2.9 樣品含量測定 取3批HXDTM樣品(批號：20120628、20120816、2011012)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，樣品量為10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述高效液相色譜條件進樣，記錄色譜圖，按外標法計算HXDTM中丹參素鈉和原兒茶醛的含量，結果見表2。

根據上述結果，考慮到每批藥材的產地、質量及生產過程中純化水用量及藥材的稱量等所帶來的誤差，暫定本品中每100 mL含丹參素不得少于9.0 mg，含原兒茶醛不得少于1.2 mg。

表2 樣品測定結果(n=3)

3 討論

3.1 流動相的選擇 丹參的水溶性成分丹參素和原兒茶醛均是酚酸類化合物，極性大，在水溶液中易溶解，與空氣接觸極易氧化成醌式結構化合物，在偏堿溶液時更易氧化，使溶液呈桔黃色，在中性流動相中存在著離解平衡而使測定的結果偏低且色譜峰易產生拖尾現象，所以，目前在測定上述兩種物質時，在流動相中加入適量酸，既抑制其氧化也可抑制其拖尾，乙腈能使色譜峰保持良好的峰形[8-9]。在實驗初期，考察甲醇-磷酸水溶液、甲醇-冰醋酸水溶液、甲醇-乙腈-冰醋酸水溶液[10-16]及不同比例等多個流動相系統的效果，均難以獲得較好的分離度和峰形，結果選擇乙腈-0.5%冰醋酸作為流動相，分離效果較好[17-18]。

3.2 流動相比例的確定 實驗中考察了混合對照品標準溶液(“2.3”線性關系考察項下方法制備)在不同比例的乙腈與0.5%冰醋酸的流動相體系下的出峰時間及峰形等的分離效果，在幾個不同流動相比例1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的分離效果中，以乙腈-0.5%冰醋酸為1∶3時分離效果最優，峰形對稱，柱效高，保留時間適宜，干擾成分少，丹參素鈉、原兒茶醛均可達到基線分離。

3.3 檢測波長的選擇 實驗是在同一色譜系統中對丹參素鈉和原兒茶醛同時檢測，因此，找到二者共同的最大吸收波長選擇尤為重要。實驗中將丹參素鈉和原兒茶醛對照品溶液分別在200～400 nm波長范圍內進行紫外掃描，丹參素鈉和原兒茶醛均在280 nm波長處有最大吸收，且吸收良好，利于含量測定，故選用280 nm作為檢測波長；流動相比例確定以后，考察了流動相對兩種活性成分丹參素鈉和原兒茶醛在280 nm吸收的影響，結果影響不明顯。

3.4 柱溫的確定 柱溫對于分離的效能也有影響，合適的柱溫能調整保留時間，提高分離度，在擬定的色譜條件下，調整柱溫在室溫及30、35、40、50 ℃條件下分別進樣分析，考察柱溫對分離的影響，結果表明：理論塔板數N基本隨著溫度升高而增大；隨著柱溫升高，各物質峰的保留時間均逐漸提前，這可能是由于溫度升高使化合物在兩相之間的分子運動加快引起；分離度R在室溫時較差，其余溫度下影響不大；不對稱性因子S除室溫和50 ℃較大外，其他均比較理想，故在30～40℃范圍內均為適合的柱溫。但考慮到升溫導致色譜柱的穩定性差、壽命低，綜合考慮選擇35 ℃為測定柱溫。

3.5 柱長的選擇 在相同色譜條件下，色譜柱長短不一樣時，柱子越長，保留時間就越長。柱長選用150 mm，丹參素鈉的保留時間為5.30 min左右；柱長選用250 mm，其保留時間為8.90 min左右，色譜柱內徑小對色譜峰分離效果要好，但測試中產生的壓力也高。因此，實驗選用柱長以250 mm為好。

3.6 流動相的速度 在相同色譜條件下，只改變流動相的速度，進行實驗操作，流動速度增大，保留時間就縮短。實驗中通過調整流動相比例與流動速度，使其相匹配，產生的色譜峰分離效果好，色譜峰峰形穩定、對稱，測得數據準確可靠，實驗中實際選用流動相速度為1.0 mL/min。

HXDTM是由丹參等十多味藥材經過水提工藝制得的，丹參是方中主藥之一，而水溶性成分丹參素和原兒茶醛是丹參中主要成分，因此，將丹參素和原兒茶醛作為含量考察指標之一，建立了含量測定方法；但中藥復方制劑的藥效是多種化學成分共同作用的結果，單一一味藥中的一種或幾種成分含量的高低并不能全面反映中藥復方制劑的藥效，方中其他有效成分含量測定的實驗有待進一步研究。本實驗中供試品經簡單處理后即可測定，方法簡便、快速、重復性好、專屬性好，可用于HXDTM的質量控制。

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