依達拉奉對大鼠星形膠質細胞水通透性的影響

李 穎，趙興敏

0 引言

心臟驟停(Cardiac arrest,CA)后腦損害既是心肺復蘇(Cardiopulmonary resuscitation,CPR)后的表現[1]，也是導致病情加重直至死亡的主要原因之一[2]。大多數幸存者復蘇后表現為昏迷和意識障礙并最終出現慢性傷殘[3]。水通道蛋白家族(Aquaporins，AQPs)是一組與水電解質運輸平衡密切相關的選擇性細胞膜轉運蛋白。星形膠質細胞是大腦主要的細胞，心臟驟停復蘇后會出現水腫。本研究通過構建缺氧復氧模型，觀察依達拉奉對星形膠質細胞模型水通透性和水通道蛋白4(AQP4)的影響，以探討依達拉奉是否在心臟驟停復蘇后的水腫中具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠星形膠質細胞原代培養 新生1～2 d Wistar大鼠乳鼠，經75%酒精消毒，斷頭處死，取腦放入冷的D-Hanks平衡鹽溶液，去除腦膜及大血管。分離兩側大腦皮質并剪成1 mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶37 ℃空氣浴震蕩消化10 min，用含10%FBS的DMEM培養基終止消化，1 000 rpm離心 10 min，去上清，再用含10%FBS的DMEM培養基重懸沉淀。經75 m篩網過濾，收集濾液，1 000 rpm離心 10 min，收集沉淀用含10%FBS的DMEM培養基重懸，調整細胞密度至1.5×106/mL，種植于75 cm2培養瓶，經1 h差速黏附去除成纖維細胞后，將細胞懸液轉移到一新的75 cm2培養瓶繼續培養，2 d換液1次。7 d后將培養瓶放入水平搖床，37 ℃,260 rpm 2 h，換液棄除小膠質細胞，放入培養箱平衡1 h，重新置于水平搖床，37 ℃，260 rpm 18 h，換液棄除少突膠質細胞，用新鮮培養基洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA 1∶1混合液消化、傳代備用。采用GFAP兔抗大鼠多克隆抗體進行星形膠質細胞純度鑒定(GFAP陽性率達95%以上)。

1.2 實驗分組 將GFAP陽性率為95%以上細胞經胰酶消化后，用新鮮DMEM稀釋至1×104細胞/mL濃度。將細胞懸液分裝至96孔板內，并將平板放于5%CO2培養箱中，37 ℃培養至平板底部60%有細胞為止。更換新鮮的10%FBS的DMEM培養基，置37 ℃、5%(體積分數) CO2、95%(體積分數) N2的培養箱內進行缺氧培養8 h，8 h后即刻將接入95%(體積分數)N2的接口斷開，重新接入95%(體積分數)的空氣進行復氧培養9 h。將96孔板分成如下各組：空白組：細胞直接培養至實驗結束；對照組：細胞直接培養，直接進行缺氧和復氧操作；刺激組：在缺氧處理前，向細胞中加入依達拉奉至終濃度為0.1、1、10、100 μg/mL，然后進行缺氧和復氧操作。

1.3 細胞水通透性檢測 取出不同時間(通氧前、缺氧8 h、通氧3 h、通氧6 h和通氧9 h)各組3個孔的細胞，檢測細胞對[3H]water (200 mCi/mL,Sigma)的通透性(Pd),結果以cm/sec表示。

1.4 Real time PCR 取出不同時間(通氧前、缺氧8 h、通氧3 h、通氧6 h和通氧9 h)各組3個孔的細胞，胰酶消化細胞，用PBS洗脫，400×g或1 700 rpm離心5 min，去上清，收集細胞。使用TRIzol Reagent試劑盒抽提細胞的總mRNA,并用DEPC水定量至5 μg/μL。使用PrimeScript One Step RT-PCR Kit將總mRNA擬轉錄成cDNA，并定量。特異性引物為：GAPDH-F:5′-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′,GAPDH-R:5′-GCTCCGGAAGATGGTGATGG-3′;AQP4F:5′-TGGTTCAGTGCTTCGGCCAC-3′;AQ-P4R5′-CCAGCAGTGAGGTTTCCATG-3′,均為上海生工合成。以GAPDH為內參，使用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒和伯樂的IQ5 PCR系統擴增cDNA中的組織因子基因片段和GAPDH基因片段，反應條件設置為：95 ℃變性5 min，94 ℃變性30 s,57 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,30個循環，72 ℃延伸10 min。計算每個樣品TF和GAPDH的△Ct，并采用△△Ct法計算每個樣品中TF的mRNA轉錄倍數[14]。

1.5 Western Blot 取出不同時間(通氧前、缺氧8 h、通氧3 h、通氧6 h和通氧9 h)各組3個孔的細胞，胰酶消化細胞，用PBS洗脫，400×g或1 700 rpm離心5 min，去上清，用緩沖溶液[50 mM Tris-HCl,pH 7.4,150 mM NaCl,1%Nonidet P-40,0.5%deoxycholic acid,0.1%sodium dodecyl sulfate(SDS),5 mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA),2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF),20 μg/mL aprotinin,20 μg/mL leupeptin,10 μg/mL pepstanin A,and 150 mM benzamidine]重懸細胞至5×1010個。破碎后12 000 rpm離心20 min后取上清進行電泳。使用5%濃縮膠和15%分離膠進行電泳分離，并使用電轉將蛋白轉至PVDF膜上。10%牛奶封閉PVDF膜1 h，37度孵育一抗1 h，然后PBST清洗3次，每次5 min，然后用37度孵育二抗稀釋液，并用PBST清洗3次，每次5 min。最后用ECL+plusTM Western blotting system kit (Amersham,USA)配置顯光液，使用3490 photo gel imaging systems (Epson,Japan)拍照并記錄，并用Image Pro PLUS軟件分析每個蛋白與GAPDH的相對量。

1.6 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，所有計量資料比較均采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺氧和復氧過程中星形膠質細胞水通透性和AQP4表達 對原代培養的細胞缺氧8 h處理，然后復氧12 h，檢測缺氧復氧過程中0 h、8 h、復氧后4 h、復氧后6 h和復氧后8 h星形膠質細胞水通透性和AQP4表達情況，結果見圖1～圖3。結果顯示，缺氧階段對照組和空白組水通透性、AQP4 mRNA和蛋白表達量差異均無統計學意義，復氧6 h和8 h時對照組水通透性、AQP4 mRNA和蛋白表達量均顯著高于空白組。說明缺氧8 h和復氧6 h或8 h均可構建出星形膠質細胞水腫模型，且細胞水腫后AQP4表達量會上升。選擇缺氧8 h和復氧6 h作為復氧模型構建方法。

圖1 缺氧和復氧過程中星形膠質細胞水通透性變化情況

圖2 缺氧和復氧過程中星形膠質細胞AQP4 mRNA表達情況

圖3 缺氧和復氧過程中星形膠質細胞AQP4蛋白表達情況

2.2 依達拉奉對星形膠質細胞水通透性和AQP4表達的影響 取缺氧8 h和復氧6 h的星形膠質細胞作為缺氧復氧模型的構建方法。按照“1.2”中的方法對細胞進行刺激，在復氧6 h時檢測各組細胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表達水平，結果見圖4～圖6。0.1 μg/mL依達拉奉刺激后，細胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表達量與對照組比較差異無統計學意義(P均>0.05),1、10或100 μg/mL依達拉奉刺激后，細胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表達量顯著低于對照組(P均<0.05),與空白組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。

圖4 不同濃度依達拉奉刺激后星形膠質細胞水通量變化情況

圖5 不同濃度依達拉奉刺激后星形膠質細胞AQP4 mRNA水平變化情況

圖6 不同濃度依達拉奉刺激后星形膠質細胞AQP4蛋白變化情況

3 討論

本文探討依達拉奉對缺氧和復氧后的星形膠質細胞AQP4表達以及細胞水腫的影響，結果如下：(1)缺氧8 h和復氧6 h或8 h可顯著增加星形膠質細胞水通量以及細胞內AQP4 mRNA水平和蛋白表達，引起細胞水腫；(2)0.1 μg/mL依達拉奉刺激無法顯著改變細胞水腫情況；(3)1、10或100 μg/mL依達拉奉刺激后,細胞水通量、AQP4 mRNA水平和蛋白表達量均顯著下降。上述結果說明，1、10或100 μg/mL依達拉奉可通過抑制AQP4 mRNA水平和蛋白表達來達到顯著抑制細胞水腫的效果。

依達拉奉是一種可以清除腦部自由基的藥物，用于治療腦梗死引起的神經病變[4-5]。大鼠實驗顯示，在缺血/缺氧再灌注后靜脈給予依達拉奉，可阻止腦水腫和腦梗死的進展，并緩解所伴隨的神經癥狀，抑制遲發性神經元死亡[6]。臨床研究顯示，依達拉奉可清除自由基，抑制脂質過氧化，從而抑制腦細胞、血管內皮細胞、神經細胞的氧化損傷[6-7]。另外，大量的研究表明，腦梗死過程中會伴隨腦水腫，主要表現為膠質細胞的水腫。膠質細胞水腫是一種常見的腦部損傷后再復蘇的癥狀，是在腦部劇烈損傷后表現的一種腦部損傷。臨床研究表明，藥物可以抑制膠質細胞水腫，進而達到保護神經病變的作用[8]。內源性H2S抑制腦水腫是常見的臨床現象，藥物刺激也會抑制[9]。因此，依達拉奉很可能也會表現為抑制星形膠質細胞水腫的臨床效果。本文的結果顯示，1、10或100 μg/mL依達拉奉會抑制AQP4 mRNA水平和蛋白表達，從而達到顯著抑制細胞水腫的效果。黃亮等[10]評價了依達拉奉干預后大鼠心肺復蘇后腦AQP4表達與腦水腫動態變化，結果得出，心肺復蘇后大腦水腫的同時，組織AQP4 mRNA和蛋白表達量均顯著升高，但依達拉奉干預后大鼠腦水腫減輕，且AQP4表達量均下降，說明依達拉奉可通過降低腦組織內AQP4的表達量來達到減輕腦水腫的作用。尹澤黎等[11]發現，依達拉奉可通過清除自由基而發揮抑制腦水腫的作用。并且在臨床上，依達拉奉聯合血塞通注射液治療可明顯減輕腦水腫[12]。屈家虎等[13]使用亞低溫聯合依達拉奉也可使顱腦外傷后腦水腫減輕。張衍等[14]進一步闡述了依達拉奉抑制水腫的分子機制，明確了AQP4被抑制后細胞水腫也被抑制。本研究發現，依達拉奉可直接作用大腦主要的神經細胞星形膠質細胞，且與上述腦水腫類似的是，依達拉奉通過抑制AQP4表達，發揮抑制神經細胞星形膠質細胞的水腫。

本研究觀察到依達拉奉對星形膠質細胞的水腫具有抑制作用，但尚未證明依達拉奉是通過抑制星形膠質細胞水腫來抑制腦部水腫，如需證明這一結論，需要在腦部組織檢測組織內星形膠質細胞AQP4表達以及水腫情況。另外，由于本文是直接藥物刺激，機體內依達拉奉是否直接刺激細胞或者通過相關途徑發揮作用，還需要進一步去研究分析。

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