RP-HPLC法測定酮洛芬凝膠中藥物含量

2014-08-15 09:06:04沙延淳楊祝仁楊紅玉

實用藥物與臨床 2014年10期

石莉，張晶，李樂，沙延淳，鄧波，楊祝仁，楊紅玉

0 引言

疼痛是運動系統常見病，見于組織定性損傷、關節退行性病變、肩周炎、腱鞘炎等疾病。酮洛芬(Ketoprofen)又名酮基布洛芬，是一種2-芳基丙酸非甾體抗炎藥，具有抗炎、鎮痛和解熱作用，對風濕、類風濕性關節炎、脊髓炎、痛風等具有較好療效[1]，是目前臨床應用較多的抗炎鎮痛藥物之一。利用口服藥物控制癥狀往往導致胃腸道及全身性的不良反應[2]。凝膠劑直接作用于患處，幾乎不參與全身循環[3-4]，外用凝膠制劑可以有效避免或緩解口服酮洛芬帶來的胃腸道不良反應。

酮洛芬凝膠為國家藥品標準收載的品種[5]，采用內標法測定酮洛芬凝膠中的藥物含量，存在局限性。為了更好地控制酮洛芬凝膠的質量，在廣泛查閱文獻[6-15]與前期試驗的基礎上，筆者建立了RP-HPLC外標法測定酮洛芬凝膠中藥物含量，該方法可有效檢出酮洛芬雜質。

1 儀器與試藥

L-3000 RIGOL高效液相色譜儀(北京普源精電科技有限公司)，Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm，迪馬公司)。酮洛芬原料藥(湖北迅達藥業股份有限公司，含量：99.7%，批號：KPO-1102026)，酮洛芬凝膠(自制，批號：110701、110702、110703，規格：10 g∶0.3 g)，色譜級乙腈(山東禹王實業有限公司)，磷酸二氫鉀(分析純，天津市博迪化工有限公司)，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調pH值至3.0)-乙腈(50∶50)為流動相，檢測波長為255 nm，流速為1.0 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：10 μL；外標法。

2.2 專屬性試驗

2.2.1 樣品制備空白輔料：精取處方量各空白輔料，制備空白凝膠，精密稱取本品適量置100 mL量瓶中，流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，離心(12 000 r/min) 15 min，取上清液濾過，取續濾液，即得。凝膠樣品溶液：精密稱取凝膠0.33 g(約相當于酮洛芬10 mg)，置100 mL量瓶中，流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，離心(12 000 r/min) 15 min，取上清液濾過，取續濾液，即得。分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見圖1。

2.2.2 結果空白輔料與空白溶劑基本一致，在酮洛芬主峰處無明顯吸收，不干擾本品的測定。

圖1 酮洛芬色譜圖

2.3 線性關系與范圍精密稱取酮洛芬對照品10.50 mg，置10 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含1.05 mg的溶液。分別精密吸取0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度。分別精密吸取10 μL溶液，注入液相色譜儀中，測定色譜峰面積。以進樣量為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。回歸方程：Y=3 717.5 X-72.678，r=0.999 9。上述試驗結果表明，酮洛芬在0.525～1.575 μg范圍內線性關系良好。

2.4 溶液穩定性試驗按含量測定項下方法，制備供試品溶液，避光放置，分別于配制后0、2、4、6、8 h取樣測定，記錄峰面積，所得酮洛芬峰面積的RSD值為1.42%。實驗結果表明，該溶液在8 h內穩定。

2.5 中間精密度試驗由3名實驗人員，分別在3 d配制供試品溶液1份，每人取樣2次，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算樣品的含量。RSD為1.13%(n=6)，表明本測定方法中間精密度良好。

2.6 重復性試驗按含量測定項下方法處理樣品(n=6)，配制供試品溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，含量RSD為1.34%，說明本方法重復性良好。

2.7 準確度試驗稱取酮洛芬對照品8、10、12.5 mg，分別置于100 mL量瓶中，再按處方比例加入空白輔料，加流動相適量，超聲溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻，按含量測定項下方法處理樣品，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率，見表1。由表1可見，各濃度下的平均回收率均在96.90%～101.17%之間，平均回收率為98.41%，RSD為1.35%，說明本方法回收率良好。

表1 酮洛芬回收率(n=3)

檢測限和定量限：逐級稀釋含量測定項下的對照品溶液，測定樣品峰的峰高，同時測定相同條件下的色譜基線噪聲，當S/N≈3時，檢測限為0.5 ng；當S/N≈10時，定量限為5 ng。

2.8 供試品含量的測定精密稱取本品適量(約相當于酮洛芬10 mg)，置100 mL量瓶中，加流動相適量，超聲溶解，放冷至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻；取上述溶液適量，離心(12 000 r/min) 15 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，精密量取續濾液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另精密稱取酮洛芬對照品適量，加流動相溶解，制成0.1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液，同法測定，按外標法以峰面積計算，即得。按照上述色譜條件和檢測方法，對3批中試樣品及市售藥品進行測定。三批供試品的測定結果分別為100.20%、100.08%、100.10%。

2.9 光照試驗及光照對含量測定的影響試驗中發現，酮洛芬對光敏感。為了進一步了解光照對酮洛芬凝膠的影響，進行了酮洛芬凝膠光照試驗的研究。

取本品適量，置強光照射[(4 500±500) Lx]條件下，分別于5、10 d取樣，按含量測定項下方法處理樣品，取續濾液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。

圖2 酮洛芬光照試驗色譜圖

由圖2可知，隨著光照時間的增加，2號峰峰面積有顯著增加。通過文獻調研和前期試驗，推斷2號峰物質為1-(3-benzoylphenyl)ethanone，該物質為美國藥典酮洛芬項下有關物質D[16]，歐洲藥典酮洛芬項下有關物質A[17]。通過購買1-(3-benzoylphenyl)ethanone雜質對照品(EP)，得到圖2中B圖譜，確定2號峰物質為1-(3-benzoylphenyl)ethanone，即酮洛芬雜質A(EP)。

比較光照0、5、10 d的數據，記錄雜質A的峰面積百分比，計算雜質A與酮洛芬的相對保留時間RRT、酮洛芬的含量百分比，結果見表2。

表2 光照試驗結果

結果表明，經光照，酮洛芬含量明顯降低，雜質A峰面積百分比明顯增加。而且隨著光照時間的延長，雜質A明顯增加，雜質A為酮洛芬的光照降解產物。

3 討論

3.1 凝膠樣品處理方法的篩選因為本品選用卡波姆為凝膠基質，該高分子物質不適合進入液相色譜系統。如何選擇一種適宜的方法去除卡波姆，成為RP-HPLC法測定本凝膠中酮洛芬含量的關鍵。筆者嘗試了透析法、離心法、超濾法等一系列方法，最終選擇離心法，用于制備含量測定樣品。該方法簡便、快捷，可靠。

3.2 離心處理條件的篩選精密稱取酮洛芬凝膠適量(約相當于酮洛芬30 mg)，置100 mL量瓶中，加流動相適量，超聲使溶解，放冷至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻；于不同條件下離心處理，取上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，制備供試品溶液。見表3。由表3可知，4 ℃下，本品經12 000 r/min離心處理效果較好，離心時間為10～15 min。

3.3 含量測定方法關于酮洛芬含量測定方法的文獻較多，包括滴定法、紫外可見分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、液質聯用(LC-MS)等。本文在廣泛查閱文獻的基礎上，建立了RP-HPLC法測定酮洛芬凝膠中藥物含量，該方法能夠有效分離并確認了酮洛芬的光降解雜質1-(3-benzoylphenyl)ethanone，這一點在其他含量測定方法文獻中未有涉及。