丹參酮ⅡA、苦參堿、川芎嗪對PC12細胞抗腫瘤活性的研究

馬 輝，范 青*，胡增春，胡慧敏，呂慧怡，程荔春，何玉芳，張 策，郝堂娜

0 引言

PC12細胞是從大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆的細胞系，主要分泌產物為兒茶酚胺類遞質，包括多巴胺、去甲腎上腺素等。因其具有可傳代培養的特點，作為神經元細胞模型，廣泛用于神經生理、病理及藥理方面的研究，有助于闡明神經系統疾病的發病機制、藥物療效，探索新的藥物與治療手段[1]。

丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,TanⅡA)是丹參酮脂溶性成分的代表，藥理作用極其廣泛，包括抗氧化、抗炎、心肌保護、抗腫瘤等作用[2]。近年來，國內外學者對其抗腫瘤作用較為關注，發現TanⅡA對多種腫瘤細胞具有細胞毒性作用，能抑制腫瘤細胞增殖，可誘導腫瘤細胞分化和凋亡[3-4]。苦參堿(Matrine，Mat)作為一種傳統的中藥成分，在抗炎、抗心律失常方面有重要的應用價值。同時，苦參堿具有較廣的抗瘤譜，對多種腫瘤細胞株及移植瘤有較高的抑制率[5-7]。川芎嗪(Ligustrazine，LZ)系從傳統中藥川芎中提取出來的有效生物堿成分，近年來，川芎嗪的抗腫瘤作用備受國內外研究者的關注，主要作用：逆轉腫瘤細胞多藥耐藥(MDR)、免疫腫瘤、放療增敏、化療增效、抗腫瘤轉移[8]。

大量文獻表明，丹參酮ⅡA、苦參堿、川芎嗪均有抗腫瘤活性，并且具有逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的作用。其中，川芎嗪能抑制MDA-MB-231細胞的體外增殖，且抑制作用表現為時效和量效關系；并能通過阻滯細胞周期于G0/G1期，抑制乳腺癌細胞凋亡。苦參堿對人腦膠質瘤BT325細胞具有明顯的增殖抑制和促進凋亡的作用[9]。丹參酮ⅡA 能夠顯著降低人膠質瘤細胞系U87遷移作用[10]。本試驗主要研究丹參酮ⅡA、苦參堿、川芎嗪對于PC12細胞的抗腫瘤活性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 PC12細胞來源于大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤，由大連醫科大學病理教研室提供，廣泛用于神經系統疾病的體外研究。-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.1.2 主要試劑 川芎嗪(南京澤朗醫藥科技有限公司)、丹參酮ⅡA(西安保賽天然產物科技有限公司)、苦參堿(西安保賽天然產物科技有限公司)；胎牛血清(Hyclone公司)、PBS(北京中杉金橋公司)、DMEM(北京艾然生物科技有限公司)、MTT(北京索萊寶科技有限公司)、DMSO(Hyclone 公司)、NaHCO3(北京中杉金橋公司)、雙抗(青霉素及鏈霉素溶液，Hyclone 公司)、胰酶(美國Sigma)。

1.1.3 主要儀器 CO2恒溫培養箱(美國Thermo)，臺式高速冷凍離心機(美國Sigma)，酶標儀(美國Sigma)，電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)，超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，倒置式生物顯微鏡(中國XD-101)，自動渦旋混合器(天津藥典標準儀器廠)，溶劑過濾器(天津藥典標準儀器廠)，恒溫水浴箱(江蘇榮華儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇與培養 根據細胞的復蘇“慢凍快融”的原則：取出凍存的PC12細胞株，迅速放入37 ℃恒溫水浴箱內，將細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化，立即加入到配制好的DMEM培養基，置37 ℃、5%CO2培養箱中培養，24 h后換液1次，連續傳代至對數生長期。

1.2.2 溶液的制備 丹參酮ⅡA溶液的制備：精密稱取丹參酮ⅡA 50 mg溶于6 mL DMSO中，得8.33 mg/mL的母液，用DMEM培養液稀釋得到濃度為20 μg/mL的溶液。置4 ℃冰箱中備用?？鄥A溶液的制備：精密稱取苦參堿12.8 mg溶于4 mL DMEM培養液中，得到濃度為3.2 mg/mL的溶液，置4 ℃冰箱中備用。川芎嗪溶液的制備：精密稱取川芎嗪12.8 mg溶于4 mL DMEM培養液中，超聲使其溶解，得到濃度為3.2 mg/mL的溶液，置4 ℃冰箱中備用。MTT溶液的制備：精密稱取MTT 40 mg，用8 mL PBS溶解，得到濃度為5 mg/mL的溶液，置4 ℃冰箱中避光保存。

1.2.3 細胞計數 ①蓋好蓋玻片：取一套血球計數板，將特制的蓋玻片蓋在血細胞計數槽上。②制備計數用的細胞懸液：用吸管吸取細胞懸液、錐蟲藍染液(0.4%)各1滴，吹均勻。③將細胞懸液滴入計數板：吸取少量吹勻的細胞懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，至蓋玻片下充滿懸液。④統計4個大格的細胞數：將血細胞計數板放于顯微鏡的低倍鏡下，觀察計數。⑤計算原細胞懸液的細胞數：按照下面公式計算細胞密度：細胞懸液的細胞數/mL=(4個大格子細胞數/4)×2×105。計算出細胞密度為9.28×106個/mL。

1.2.4 細胞鋪板 取對數生長期細胞，用胰酶溶液(0.25%胰酶∶0.02%EDTA=1∶1，v/v)消化。將上述溶液用培養基稀釋，使細胞懸液的細胞密度為9.28×106個/mL，分別取100 μL接種于96孔板中，孵箱中培養24 h。

1.2.5 MTT法測定[11]37 ℃培養后，棄上清液，加入待測藥物，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養24 h，棄上清液，加入含0.2 mg/mL MTT的無血清培養基后，繼續培養4 h，棄上清，并加入20 μL DMSO溶解MTT甲臜沉淀，置搖床上低速振蕩15 min，使結晶物充分溶解，混勻。在酶標儀492 nm處測量各孔的吸光度值A。抑制率=(A對照組-A給藥組)/A對照組×100%。

1.2.6 體外藥效學實驗 用培養基將丹參酮ⅡA稀釋至濃度分別為：67.95、33.98、16.99、8.49、4.25、2.12、1.06、0.53、0.27 nmol/mL。用培養基將苦參堿稀釋至濃度分別為：12.89、6.44、3.22、1.61、0.81、0.40、0.20、0.10、0.05 μmol/mL。用培養基將川芎嗪稀釋至濃度分別為：23.50、11.75、5.87、2.94、1.47、0.73、0.37、0.18、0.09 μmol/mL。

按照MTT法，測量各孔的吸光度值A，計算其抑制率，并用Origin軟件計算IC50值。每個濃度3個樣本，比較3種藥物的IC50值，從而比較其抗腫瘤活性。

2 結果

2.1 細胞形態觀察

2.1.1 丹參酮ⅡA對細胞形態的影響 PC12細胞經丹參酮ⅡA處理后，細胞凋亡情況見圖1。如圖1所示，與對照組相比，低濃度丹參酮ⅡA對細胞增殖有抑制作用。0.27 nmol/mL丹參酮ⅡA處理細胞后，胞體折光性好，突起明顯；當用濃度為16.99 nmol/mL丹參酮ⅡA作用于PC12細胞時，顯示典型的凋亡細胞形態學特征，核仁減少、固縮，折光性降低，核內異染色質明顯增多，并沿核膜邊沿聚集，胞質內充滿大小不等的空泡；當丹參酮ⅡA濃度達67.95 nmol/mL時，細胞變圓離壁，突起減少，固縮，顆粒明顯增多，部分細胞漲大破裂。

圖1 丹參酮ⅡA對細胞形態的影響

2.1.2 苦參堿對細胞形態的影響 PC12細胞經苦參堿處理后，細胞凋亡情況見圖2。由圖2可見，與對照組相比，0.05 μmol/mL苦參堿處理細胞后，細胞形態好，胞體折光性好，突起明顯；苦參堿濃度達3.22 μmol/mL時，細胞固縮，突起減少，胞漿內可見有顆粒，折光性減弱；當苦參堿濃度達12.89 μmol/mL時，細胞輪廓變模糊，變圓離壁，突起減少，變短，胞漿內顆粒明顯增多。

圖2 苦參堿對細胞形態的影響

2.1.3 川芎嗪對細胞形態的影響 PC12細胞經川芎嗪處理后，細胞凋亡情況見圖3。如圖3所示，與對照組相比，川芎嗪濃度<0.09 μmol/mL時，細胞形態無明顯變化，輪廓清晰，胞體折光性好，細胞突起明顯；11.75 μmol/mL川芎嗪作用于PC12細胞24 h后，即對其細胞增殖有抑制作用，細胞突起減少，細胞折光性減弱，胞漿內可見有顆粒；川芎嗪濃度達23.50 μmol/mL時，細胞輪廓變模糊，細胞變圓離壁，變短，部分細胞漲大破裂。

2.2 各給藥組IC50值比較 各給藥組IC50值結果見表1。細胞生長曲線見圖4，由圖4可知，這3種藥物不同濃度時，都能有效抑制PC12細胞的增殖，且細胞生長率隨著藥物濃度的增加而增大。當丹參酮ⅡA的藥物濃度≤0.27 nmol/mL時，藥物對細胞的抑制作用不明顯；隨著藥物濃度的增加其抑制作用增強，當藥物濃度達23.21 nmol/mL時，其抑制率達50%。當苦參堿的藥物濃度≤0.05 μmol/mL時，藥物對于細胞的抑制作用不明顯；當藥物濃度達11.36 μmol/mL時，即能夠將半數細胞殺死。當川芎嗪的藥物濃度≤ 0.09 μmol/mL時，藥物對細胞生長沒有明顯的抑制作用；當藥物濃度達20.32 μmol/mL時，其抑制率達50%。通過這3種抗腫瘤藥物的實驗研究可知，丹參酮ⅡA與川芎嗪及苦參堿對比，具有顯著的抗腫瘤活性。

表1 4種藥物對PC12細胞株的抑制作用比較

圖3 川芎嗪對細胞形態的影響

圖4 細胞生長曲線

3 討論

目前，惡性腫瘤的治療方法仍然是以手術、化療、放療為主的綜合治療。臨床常用的化療藥物主要是通過細胞毒作用殺傷腫瘤細胞，但由于大多數化療藥物毒性大，許多患者難以承受[12]。另一方面，某些腫瘤細胞因對化療藥物或放射線不敏感而導致治療效果不理想。因此，臨床急需開發毒性小、治療效果好的抗腫瘤藥物，可以降低患者死亡率及減小化療藥物的毒副作用，并提高其生活質量。近年來，許多中藥單體具有非常好的抗腫瘤活性，而且毒副作用較小，其抗腫瘤作用機制除直接殺死腫瘤細胞之外，還與逆轉腫瘤細胞多藥耐藥有關。

本試驗應用MTT比色法觀察丹參酮ⅡA、苦參堿、川芎嗪對PC12細胞生長的影響，通過丹參酮ⅡA與苦參堿及川芎嗪進行比較，三者的抗腫瘤活性比較差異有統計學意義(P<0.05)，3種抗腫瘤藥物的IC50值分別為23.21 nmol/mL、11.36 μmol/mL、20.32 μmol/mL，表明3種藥物對PC12細胞都具有抗腫瘤作用，但由于川芎嗪和苦參堿只有在濃度很高時才能發揮明顯的抑制作用，所以其毒性較大，安全范圍小。丹參酮ⅡA主要用于冠心病、痤瘡、痛經、失眠及抗菌消炎等非腫瘤疾病的治療，近年研究發現，丹參酮ⅡA還具有很強的抗腫瘤活性，可能成為一種很有潛力的抗癌新藥。丹參酮ⅡA在濃度很低時，即對腫瘤細胞的生長增殖具有較強的抑制作用，促進細胞凋亡，其濃度與抑制率呈明顯的劑量依賴效應，隨著濃度的增加其抑制作用增強。研究表明，丹參酮ⅡA的抗腫瘤作用主要表現在以下幾個方面：細胞毒作用，對腫瘤細胞的誘導分化作用，誘導細胞凋亡的作用[13-14]。結合進一步的體內試驗，包括血腦屏障試驗、間質內療法等，可為丹參酮ⅡA最終用于交感神經系統腫瘤患者提供充分的實驗依據。

參考文獻：

[1] Mouri K,Sako Y.Optimality conditions for cell-fate heterogeneity that maximize the effects of growth factors in PC12 cells[J].PLoS Comput Biol,2013,9(11):e1003320.

[2] 陳妹,張靜,吳艷峰,等.丹參酮ⅡA磺酸鈉的臨床應用研究進展[J].中國醫藥,2012,7(2):253-254.

[3] Jung JH,Kwon TR,Jeong SJ,et al.Apoptosis induced by tanshinone IIA and cryptotanshinone is mediated by distinct JAK/STAT3/5 and SHP1/2 signaling in chronic myeloid leukemia K562 cells[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013:805639.

[4] Su CC.Tanshinone IIA potentiates the efficacy of 5-FU in Colo205 colon cancer cells in vivo through downregulation of P-gp and LC3-II[J].Exp Ther Med,2012,3(3):555-559.

[5] 任莉莉,王曉稼.苦參堿抗腫瘤作用及其機制研究進展[J].中國醫師雜志,2012,14(2):281-283.

[6] Zhou H,Xu M,Gao Y,et al.Matrine induces caspase-independent program cell death in hepatocellular carcinoma through bid-mediated nuclear translocation of apoptosis inducing factor[J].Mol Cancer,2014,13(1):59.

[7] Chang C,Liu SP,Fang CH,et al.Effects of matrine on the proliferation of HT29 human colon cancer cells and its antitumor mechanism[J].Oncol Lett,2013,6(3):699-704.

[8] Shao ZK,Li JW,Zhao ZH,et al.Effects of tetramethylpyrazine on nitric oxide/cGMP signaling after cerebral vasospasm in rabbits[J].Brain Reserch,2010,1361:67-75.

[9] 程光,章翔,費舟,等.苦參堿對BT325膠質瘤細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用[J].第四軍醫大學學報,2002,23(23):2152-2154.

[10]Lu DY,Leung YM,Cheung CW,et al.Glial cell line-derived neurotrophic factor induces cell migration and matrix metalloproteinase-13 expression in glioma cells[J].Biochem Pharmacol,2010,80(8):1201-1209.

[11]Bao R,Shu Y,Wu X.Oridonin induces apoptosis and cell cycle arrest of gallbladder cancer cells via the mitochondrial pathway[J].BMC Cancer,2014,14(1):217.

[12]Zhang HT,Luo H,Wu J,et al.Galangin induces apoptosis of hepatocellular carcinoma cells via the mitochondrial pathway [J].World J Gastroenterol,2010,16:3377-3384.

[13]吳慶慶.丹參酮ⅡA對肺腺癌NCI-H460細胞增殖和凋亡的影響[J].實用醫學雜志,2012,28(6):877-879.

[14]Hui Ma,Qing Fan,Jia Yu,et al.Novel microemulsion of tanshinone IIA,isolated from Salvia miltiorrhiza Bunge,exerts anticancer activity through inducing apoptosis in hepatoma cells[J].Am J Chin Med,2013,41(1):197-210.