神經生長因子在異丙酚對大鼠海馬神經元缺氧/復氧損傷中的作用及機制

馮婭妮，石 強，孫艷紅

0 引言

腦缺血再灌注損傷最初可出現腦血流降低，導致發生膜去極化。除氯胺酮外，幾乎所有麻醉藥都劑量相關性地減少腦代謝活動，推遲膜去極化發生的作用。缺血再灌注后繼發氧自由基釋放、興奮性氨基酸釋放增加、凋亡基因激活及血腦屏障的破壞等嚴重損傷腦組織的正常結構和功能。丙泊酚與氧自由基反應，以低活性的自由基取代了高活性的自由基，減輕脂質過氧化級聯反應，成為其神經保護作用的重要機制[1]。已有研究表明，單次異丙酚預處理能夠減輕大鼠缺氧/復氧引起的海馬神經元的損傷,而多次藥物預處理是否增強腦保護的效果尚不清楚[2-4]。因此，本研究擬探討不同劑量異丙酚預處理對缺氧/復氧損傷的海馬神經元作用及神經生長因子(Nerve growth factor,NGF)及其受體的作用,為異丙酚的神經保護作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 神經元的培養 出生時間<24 h新生SD大鼠，體重5～6 g,由中國醫科大學實驗動物部提供，用75%酒精浸泡消毒后迅速斷頭，沿大腦中縫剪開左右半球，分別取兩側大腦，在解剖顯微鏡下分離出海馬。將海馬組織塊移入0.125%胰蛋白酶(Sigma公司，美國)的解剖液中，在含9.5%CO2的孵箱中36.5 ℃消化30 min。以5×105個/min的神經元密度接種在直徑35 mm無菌培養皿或孔板中(Coster公司，美國)，2 mL/皿或100 μL/孔，置于含10%CO2的培養箱中37 ℃培養9 d。

1.2 分組及處理 以海馬神經元培養皿或孔板為觀察單位，隨機分為7組：對照組(Con組)，未做任何處理；CoCl2組(CoCl2組)：加入300 μm的CoCl2處理1 h，然后更換正常的培養基培養24 h，之后更換無血清的培養基培養；脂肪乳劑組(Intra組)，培養孔中加入10%脂肪乳劑90 μL(四川樂山裕恒藥業公司，批號：0010801)；異丙酚組(Prop組)(AstraZenca，批號：CN066)培養孔中加入用DMEM稀釋至終濃度10、20、50、100 μM的異丙酚1 h后，其余處理同CoCl2組。用RT-PCR檢測NGF mRNA和TrkA mRNA的表達。為進一步研究NGF/TrkA 在異丙酚預處理中的作用，本研究將海馬神經元細胞分為4組，分別為對照組(Con組)，CoCl2組，50 μM濃度的異丙酚組，1.0 μmol/L K252a組，用Western blot檢測TrkA 蛋白表達。

1.3 MTT自動比色法檢測神經元活力 每組36孔，每孔加MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL 二甲亞砜(DMSO)，振蕩15 min，選擇490 nm波長測OD值以判斷細胞活力。

1.4 流式細胞法檢測細胞凋亡 將神經元接種于6孔板，按“1.2”項方法進行分組，PBS洗滌后吹打成單細胞懸液，以PBS沖洗2次，70%預冷乙醇4 ℃下懸浮固定細胞，-20 ℃過夜，PBS洗滌2遍，用10 mg/L PI和1 g/L RNaseA,40 ℃避光染色30 min,上流式細胞儀檢測，每一實驗組檢測6份標本，Cellfit軟件收集10 000個細胞，CellQuest軟件獲取并分析數據，記錄AP區亞峰細胞百分率，即為細胞凋亡百分率。

1.5 RT-PCR檢測異丙酚預處理后NGF mRNA和 TrkA mRNA的表達變化 分別在預處理后24 h收集細胞提取RNA。采用TRAZOL 試劑盒，RNA的逆轉錄采用PROMEGA 公司的逆轉錄試劑盒，采用隨機寡聚六磷酸核苷酸引物合成cDNA。以GAPDH為內對照。特異性引物序列和of 180 base pairs(bp);TrkA:sense′-GGTACCAGCTCTCCAACACTGAGG-3′antisense,5′-CCAGAACGTCCAGGTAACTCGGTG-3′product size of 260 base pairs(bp);PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠進行電泳,在凝膠分析成像系統進行半定量的分析。

1.6 Western blot法檢測TrkA蛋白的表達 免疫沉淀Western blot 技術:吸去細胞培養液，用冰冷PBS 輕輕沖洗，收獲細胞后抽提細胞總蛋白，BCA 法蛋白定量后將蛋白濃度調至等濃度。以30 μg 的蛋白樣本經10%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，再轉移至PVDF 膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉印跡膜2 h。加入各抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜，再用辣根過氧化物酶標記相應的二抗，室溫孵育1 h。ECL 化學發光系統檢測反應產物信號。同一張印跡膜曝光后，以0.5%的十二烷基硫酸鈉洗脫一抗，再與相應總蛋白抗體孵育雜交，所得結果作為內參對照。

2 結果

2.1 不同濃度異丙酚預處理對海馬神經元活力的影響 經過濃度為50 μM的異丙酚預處理后，在無血清培養條件下，海馬神經元的活力比無預處理組明顯增高(P<0.01),10、20、100 μM濃度的異丙酚預處理后，與缺氧/復氧組相比差異無統計學意義(P>0.05)，脂肪乳劑組與單純缺氧/復氧組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 不同濃度異丙酚預處理對海馬神經元凋亡的影響 50 μM的異丙酚預處理后，海馬神經元的凋亡比無預處理組明顯減少(P<0.01),10、20、100 μM濃度的異丙酚預處理后與缺氧/復氧組相比差異無統計學意義(P>0.05)，脂肪乳劑組與單純缺氧/復氧組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 異丙酚預處理對各組海馬神經元細胞缺氧/復氧后細胞活力和細胞凋亡的變化

2.3 不同濃度的異丙酚預處理對NGF mRNA和 TrkA mRNA表達的影響 50 μM的異丙酚預處理使NGF mRNA及 TrkA mRNA的表達水平上調(P<0.01或P<0.05 ),10、20、100 μM的異丙酚預處理后與缺氧/復氧組相比，NGF mRNA和TrkA mRNA的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、圖2。

圖1 不同濃度異丙酚預處理對缺氧/復氧損傷的海馬神經元NGF mRNA表達的影響

圖2 不同濃度異丙酚預處理對缺氧/復氧損傷的海馬神經元TrkA mRNA表達的影響

2.4 K252a對異丙酚預處理的影響 1.0 μmol/L K252a 使TrkA 蛋白的表達水平下調(P<0.01)，同時使異丙酚預處理對海馬神經元的保護作用消失,細胞活力降低(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 K252a對TrkA蛋白表達的影響表達的影響

圖4 K252a對海馬神經元細胞活力的影響

3 討論

大量的研究表明,異丙酚具有中樞保護作用，但其機制仍不十分明確。本研究表明，用50 μM異丙酚預處理對海馬神經元細胞缺氧/復氧損傷有保護作用，這種保護作用是異丙酚通過誘導神經因子NGF及其受體TrkA的表達來完成的。

目前研究腦缺血再灌注損傷多采用動物模型，本研究從細胞水平進行腦保護的研究，用CoCl2模擬乏氧刺激，建立了一種簡便細胞乏氧模型。CoCl2是現在比較公認的化學乏氧的模擬物,可以誘導低氧過程的關鍵因子低氧誘導因子1-α的上調，從而調節低氧的諸多效應基因的表達變化[5]。我們在實驗中用300 μM CoCl2處理神經元，發現細胞的增殖下降和凋亡增高。

研究表明，異丙酚在10～100 μmol/L已表現出顯著的抗氧化活性[6]，本研究分別用10、20、50、100 μM的異丙酚對海馬神經元進行預處理，結果顯示，50 μM異丙酚預處理后，明顯增加海馬神經元的活力，減少凋亡。因為異丙酚溶于10%脂肪乳劑中，為排除脂肪乳劑的影響，本研究以10%脂肪乳劑作為對照，結果發現脂肪乳劑不影響海馬神經元的凋亡。NGF是神經營養因子家族成員之一,神經營養因子不僅調節發育過程中神經元的存活,而且能夠阻止成年神經元損傷后神經元的死亡等許多神經系統功能[7-9]。高親和力NGF受體TrkA是NGF的功能性受體,是啟動傳遞NGF生物效應的信息物質。NGF、TrkA對維持損傷神經元的結構、促進神經生長和修復具有重要作用,腦缺血損傷后應用外源性神經營養，不僅可減輕神經元損傷,而且可促進運動、感覺軸突再生和神經功能的恢復[10-12]。本研究發現，海馬神經元缺氧/復氧損傷后，NGF mRNA及TrkA mRNA表達明顯減少，50 μM異丙酚預處理明顯增加NGF及TrkA的表達，細胞活性增加，凋亡減少。TrkA阻斷劑 K252a 下調TrkA 蛋白的表達水平(P<0.01)，同時使異丙酚預處理對海馬神經元的保護作用消失,細胞活力降低。因此可推斷，50 μM異丙酚預處理對缺氧/復氧后的大鼠海馬神經元有保護作用，NGF及其受體TrkA在異丙酚的預處理中起到重要的作用。

參考文獻：

[1] Dong J,Min S,Wei K,et al.Effects of electroconvulsive therapy and propofol on spatial memory and glutamatergic system in hippocampus of depressed rats[J].J ECT,2010,26(4):126-130.

[2] Luo J,Min S,Wei K,et al.Propofol protects against impairment of learning-memory and imbalance of hippocampal Glu/GABA induced by electroconvulsive shock in depressed rats[J].J Anesth,2011,25(16):657-665.

[3] He J,Huang C,Jiang J,et al.Propofol exerts hippocampal neuron protective effects via up-regulation of metallothionein-3[J].Neurol Sci,2013,34(8):165-171.

[4] Xi HJ,Zhang TH,Tao T,et al.Propofol improved neurobehavioral outcome of cerebral ischemia-reperfusion rats by regulating Bcl-2 and Bax expression[J].Brain Res,2011,1410(512):24-32.

[5] Salnikow K,Donald SP,Bruick RK,et al.Depletion of intracellular ascorbateby the carcinogenic metals nickel and cobalt results in the induction of hypoxic stress[J].J Biol Chem,2004,279(39):40337-40344.

[6] Wu GJ,Chen WF,Hung HC,et al.Effects of propofol on proliferation and anti-apoptosis of neuroblastoma SH-SY5Y cell line:New insights into neuroprotection[J].Brain Res,2011,1384(2):42-50.

[7] Butte MJ,Hwang PK,Mobley WC,et al.Crystal structure of neurotrophin-3 homodimer shows distinct regions are used to bind its receptors[J].Biochemistry,1998,37(15):16846-16852.

[8] Robinson RC,Radziejewski C,Spraggon G,et al.The structures of the neurotrophin 4 homodimer and the brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin 4 heterodimer reveal a common Trk-binding site[J].Protein Sci,1999,8(6):2589-2597.

[9] Huang EJ,Reichardt LF.Neurotrophins:roles in neuronal development andfunction[J].Annu Rev Neurosci,2001,24(2):677-736.

[10]Manni L,Di Fausto V,Fiore M,et al.Repeated restraint and nerve growth actor administration in male and female mice:effect on sympathetic and cardiovascular mediators of the stress response[J].Curr Neurovasc Res,2008,59(5):1-12.

[11]Tian L,Guo R,Yue X,et al.Intranasal administration of nerve growth factor ameliorate beta-amyloid deposition after traumatic brain injury in rats[J].Brain Res,2012,1440(4):47-55.

[12]Tapia V,Gabler F,Munoz M,et al.Tyrosine kinase A receptor(trkA):a potential marker in epithelial ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,2011,121(2):13-23.