白芍總苷對NAFLD大鼠肝臟的保護作用及其機制研究

金國賢，張 文，孫偉娟，程 程，劉 瑩*

0 引言

白芍是芍藥的干燥根部，中醫理論認為其具有益氣、活血的作用。在白芍的干燥根中可分離出芍藥苷、芍藥花苷、苯甲酰芍藥苷等具有生理學活性的糖苷類混合物，統稱為白芍總苷(TGP)[1]。目前的研究表明，白芍總苷在人體內會抑制IL-1、TNF-α、細胞間粘附因子-1,阻止膠原蛋白合成或脂類物質的氧化。上述的炎癥細胞因子、脂肪細胞因子、胞間粘附因子、膠原蛋白等均是造成非酒精性脂肪肝(NAFLD)的危險因素[2-5]。本研究采用高脂飼料喂養大鼠，構建大鼠NAFLD模型，以探討白芍總苷對NAFLD大鼠肝臟的保護作用及保護機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠50只，雌雄各半，體重130～160 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK(京)2012-0004。

1.2 藥品和試劑 白芍總苷膠囊(購于寧波立華制藥有限公司)；高脂飼料(80%基礎飼料+10%豬油+6%膽固醇+4%白砂糖)以及普通喂養飼料(購于廣東省醫學實驗動物中心)；非諾貝特(FEN，購于廣州威爾曼藥業有限公司)；戊巴比妥鈉(山東魯抗醫藥股份有限公司)；谷丙轉氨酶(ALT)、谷胱甘肽巰基轉氨酶(GSH)、谷草轉氨酶(AST)測試盒以及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(購自上海研謹生物科技有限公司，批號：20130415)；IL-1、TNF-α、TGF-β(購于上海恒遠生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器 數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；-80 ℃冰箱；imarkTM酶標儀(美國伯樂有限公司)；高速冷凍離心機(日本SAKULA儀器有限公司)；BS124S分析天平(余姚紀銘承重效驗設備有限公司)；紫外可見分光光度計(上海箐華科技儀器有限公司)。

2 方法

2.1 NAFLD大鼠模型的建立 將50只大鼠適應性飼養1周后，隨機分為正常對照組10只和模型組40只。正常組給予基礎飼料，模型組給予高脂飼料喂養。模型建立成功后，根據體重隨機分為：模型對照組、非諾貝特組(200 mg/kg)；TGP低劑量組(100 mg/kg)和TGP高劑量組(200 mg/kg)，持續灌胃給藥4周，正常對照組以及模型對照組則給予生理鹽水灌胃(10 mL/kg)。

2.2 指標檢測

2.2.1 血清酶檢測 給藥干預4周后，各組大鼠禁食24 h，用5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開腹主動脈取血，冷凍離心分離血清，按照ALT、AST、GST、SOD和GSH-PX試劑盒說明書方法測定各血清酶活性，按照試劑盒步驟測定MDA含量[6]。

2.2.2 ELISA方法檢查IL-1、TNF-α、TGF-β 采用ELISA試劑盒測定大鼠血清中IL-1、TNF-α和TGF-β的含量[7]。

2.2.3 組織病理學檢查 藥物干預4周后，分別從正常對照組、模型對照組、非諾貝特組、TGP低劑量組、TGP高劑量組中隨機抽取1只大鼠，取肝左葉，用4%甲醛溶液固定，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織的病理學變化。

3 結果

3.1 白芍總苷對NAFLD大鼠肝功能的影響 與正常對照組比較，NAFLD模型對照組大鼠ALT、AST、GST活性顯著升高(P<0.05)；經非諾貝特和白芍總苷干預后模型組大鼠的ALT、AST及GST活性均降低回正常水平，與干預前比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 白芍總苷對NAFLD大鼠的血清ALT、AST、GST活性影響

3.2 白芍總苷對NAFLD大鼠體內抗氧化能力的影響 與正常對照組比較，模型對照組的大鼠SOD、GSH-PX活性顯著降低，MDA含量明顯升高(P<0.05)；經非諾貝特和白芍總苷干預治療后，模型組大鼠SOD、GSH-PX活性大大提高，MDA含量顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 白芍總苷對NAFLD大鼠SOD、GSH-PX活性及MDA含量的影響

3.3 白芍總苷對NAFLD大鼠血清中IL-1、TNF-α和TGF-β含量的影響 由統計學結果可知，與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清中IL-1、TNF-α和TGF-β的含量顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)；與NAFLD模型對照組比較，非諾貝特和白芍總苷高劑量組大鼠血清IL-1、TNF-α和TGF-β含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 白芍總苷對NAFLD大鼠血清中IL-1、TNF-α、TGF-β含量的影響

3.4 白芍總苷對NAFLD大鼠肝臟組織結構的影響 經HE染色切片后光鏡下觀察，正常組大鼠肝臟組織形態學表現正常，肝排列有序，肝索清晰可見，無病理性變化；NAFLD模型對照組大鼠肝細胞出現廣泛的脂肪變，明顯腫脹呈圓形，細胞核被脂滴擠向一側，大量肝細胞出現顆粒，肝細胞索排列紊亂；非諾貝特組和白芍總苷高劑量組大鼠肝細胞索排列較整齊，脂滴基本消失，見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理學檢查(20×)

4 討論

NAFLD是指雖無過量飲酒史卻類似于酒精性脂肪肝的肝臟組織學病變，目前NAFLD的確切發病機制尚未闡明，可能原因為三酰甘油和脂肪酸沉積在肝組織首先造成肝臟單純的脂肪性病變，在此基礎上，隨時間的增加引起慢性的氧化應激反應，造成肝臟細胞和線粒體細胞損傷及炎癥反應，促進肝細胞纖維化和壞死[8-13]。異常的細胞因子和氧化應激反應及脂肪過氧化損傷在非酒精性脂肪肝的發展中也起到關鍵性的作用，其除了能對肝臟線粒體造成不可逆的損傷外，還可以促進炎性細胞因子的形成，誘發細胞凋亡[14-16]。

本實驗通過持續給予高脂飼料建造NAFLD大鼠模型，這一模型除使大鼠具有高血壓、肝部脂肪堆積的癥狀外，還可誘發高氧化應激狀態和細胞因子的異常形成，而致肝損傷。本實驗結果表明，長期給予高脂飼料后，模型對照組大鼠肝功能明顯受到損傷，并且抗氧化能力下降，肝臟組織切片可見明顯的病理變化，提示肝功能的受損可能與過強的氧化應激反應密切相關。白芍總苷是自白芍中提取的有效活性成分，具有調節細胞因子、抗炎、鎮痛、免疫調節及抗心肌缺血的作用。中醫學認為，白芍具有養血、通痹的作用，有助于肝功能的改善，近年來，已有研究報道，白芍總苷在糖尿病腎病和免疫性肝炎方面的治療效果，其可通過上調IL-1、NF-kB、TNF-α、nephrin等細胞因子阻止膠原蛋白合成、抗脂質氧化應激反應，從而改善糖尿病腎損傷和免疫性肝炎損傷[17-19]。在本實驗中，白芍總苷組的NAFLD大鼠給藥4周后，其抗氧化酶的活性明顯提高，血清中異常細胞因子的水平顯著下降，通過抗氧化水平的提高以及降低體內異常免疫細胞因子水平，從而使血清中ALT、AST和GST的活性降低到正常值，起到肝臟保護的作用。

由以上分析結果可知，白芍總苷對高脂引起的NAFLD模型大鼠有肝臟保護的作用，其作用機制可能與其提高抗氧化能力、降低異常免疫因子水平有關。

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