RP-HPLC法測定患者血漿中異煙肼及乙酰異煙肼的濃度

張 亮，侯文潔，錢智磊，周秋云，丁紅梓，王 潔

0 引言

結核病(Tuberculosis，TB)每年會導致數百萬人死亡[1]。異煙肼(INH)是結核病初始治療方案中最重要的組成部分[2]。但有部分患者由于自身代謝能力的差異導致血藥濃度太低而最終治療失敗。乙酰異煙肼(AcINH)是INH最主要的代謝產物，也是肝毒性最大的物質，是INH在肝臟內經乙酰化而成，該過程分為快乙酰化和慢乙酰化兩種類型，其治療效果和毒副作用有所不同。肝損害多見于快乙酰化型，這可能是因為INH在體內被迅速代謝為AcINH而造成的。因此，可以通過監測相同給藥間隔后AcINH的濃度來判斷患者乙酰化的類型[3]，調整INH的給藥劑量以提高治療效率，減少毒副作用的發生。此外，肺結核的治療通常為聯合治療，而藥物聯用也會對INH的血藥濃度產生影響。因此，對結核患者進行血藥濃度監測是有必要的。

目前，已有高效液相色譜(HPLC)法分析抗結核藥物含量的報道[4-5]，但這些方法都不能用來分析成分極為復雜的血漿中的藥物濃度。也有報道使用HPLC同時測定血漿中的多組分抗結核藥，但使用了離子對試劑，后者成本過高且重現性較差[6]。液相—聯用(LC-MS)擁有超高的選擇性和靈敏度，可同時分析血漿中的多種藥物[7]，但其成本過高而且儀器在醫院尚未普及。因此，使用HPLC對多種抗結核藥及其代謝物進行血藥濃度監測依然是最常用和最經濟的方法。本文對HPLC同時測定血漿中INH和AcINH進行了方法學研究，并且使用本方法對30例患者血漿中的藥物濃度進行了監測。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AB高效液相色譜系統(檢測器為SPD-M20A，島津，日本)；渦旋儀(WH-2，上海滬西分析儀器廠有限公司)；電子分析天平(EB224，上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；高速離心機(TG1650-WS，上海盧湘儀)；微量移液器(Eppendorf，德國)。

1.2 試藥 異煙肼對照品(批號：100578-200401，中國藥品生物制品檢定所)，乙酰異煙肼對照品(批號：3-JES-102-4，Toronto Research Chemicals Inc.)，茶堿對照品(批號：100121-199903，中國藥品生物制品檢定所)。

1.3 試劑 甲醇(Merck，德國)為色譜純，磷酸二氫鉀(國藥集團，中國)、三乙胺(國藥集團，中國)均為分析純。水為自制雙蒸水(MILLIPORE，美國)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS-SP(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相：甲醇(A)-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(B,三乙胺調pH=5.6)(梯度：1～10 min梯度A∶B為4∶98，10～11 min梯度A∶B為80∶20，11 min梯度A∶B為80∶20，淋洗時間共20 min)，柱溫：40 ℃，流速：1 mL/min，進樣體積20 μL，檢測波長：261 nm。

2.2 血漿樣品處理 取血漿樣品300 μL放入2 mL離心管中，精密加入2.4 μg/mL茶堿甲醇溶液10 μL作為內標物質，渦旋混勻1 min，加甲醇700 μL，渦旋混合5 min，16 000 r/min離心15 min，取上清液經0.45 μm濾膜過濾后轉移至自動進樣器小瓶。

2.3 方法專屬性試驗 按照本方法，INH和AcINH有較好分離，互不干擾測定，血漿中的雜質峰對樣品的測定也沒有影響。色譜圖見圖1。

圖1 INH和AcINH的色譜圖

2.4 線性關系考察 精密稱取對照品置于10 mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，配成濃度分別為INH 1 000 μg/mL、AcINH 1 000 μg/mL的標準儲備液。取數支2 mL的離心管，每支加入不同量的INH和AcINH標準儲備液及300 μL空白血漿，使血漿中藥物濃度為0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4 μg/mL。按“2.2”項下操作，記錄色譜圖，以濃度(C)為橫坐標、樣品與內標峰面積比值(Y)為縱坐標進行線性回歸。見表1。

表1 回歸方程和線性范圍

2.5 精密度和準確度試驗 分別于300 μL的空白血漿中加入標準儲備液，精確配置成含低、中、高3種不同濃度INH(0.5、5、25 μg/mL)、AcINH(0.5、5、25 μg/mL)的血漿樣品，按“2.2”項下操作，測定日內(5次)和日間(5 d)精密度，RSD均<10%。見表2。

表2 日間、日內精密度試驗(n=5)

2.6 穩定性考察 在300 μL的空白血漿中加入標準儲備液，精確配置成含INH(0.5、5、25 μg/mL)、AcINH(0.5、5、25 μg/mL)濃度的血漿樣品，分別室溫放置0、2、4、8、12 h后按“2.2”項下操作，測定峰面積和內標峰面積的比值。結果表明，測定基本保持穩定。見表3。

表3 穩定性試驗結果(n=5)

2.7 回收率試驗 分別于300 μL的空白血漿中加入標準儲備液，精確配置成含低、中、高3種不同濃度INH(0.5、5、25 μg/mL)、AcINH(0.5、5、25 μg/mL)的血漿樣品，按“2.2”項下操作，每個濃度測5遍，計算平均回收率和RSD。見表4。

表4 回收率測定結果

3 血藥濃度檢測的應用

本方法成功用于30例服用INH患者的血藥濃度檢測。服藥方法為INH 0.3 g，1次/d，早飯后0.5 h頓服。早飯后2.5 h采集血樣，并于3 h內分析完畢，不能及時測試的保存在-40 ℃冰箱內。測試結果表明，患者的血漿藥物濃度差異較大。INH血藥濃度為0.34～5.9 μg/mL，平均(1.9±0.61)μg/mL；AcINH血藥濃度為0.36～3.3 μg/mL，平均(1.75±0.59)μg/mL。

4 討論

由于INH和AcINH極性較強，導致其在色譜柱上保留時間過短，且易受血漿雜質的影響。為了獲得良好的分離度和峰形，本試驗曾嘗試使用苯基柱和氰基柱[8-9]，其雖可延長保留時間，但峰形不滿意。經過反復比較和試驗，筆者認為使用C18柱以pH 5.6的磷酸二氫鉀為緩沖對，在高極性流動相的洗脫下可以得到很好的分離。

在血漿樣品處理方法中，本試驗嘗試了液液萃取法，結果發現，由于這三種組分的極性過大，用乙酸乙酯無法全部萃取，嚴重影響分析的準確性。此外，本試驗嘗試將沉淀蛋白后的上清液吹干后再用流動相復溶，結果顯示，除了增加操作步驟、給方法學的考察增加了難度外，還需加入抗氧化劑，影響了多組分藥物的穩定性。通過試驗和對比，選擇使用甲醇沉淀蛋白后直接取上清液進樣，該方法可以在不影響可靠性的前提下簡化操作步驟，方便臨床大批量樣本的檢測。

本試驗方法簡單、準確、成本較低，靈敏度不低于LC-MS，即使樣本中藥物的含量較低也能測定；保留時間較為合適，如果使用250 mm的C18柱還可以延長保留時間，增加分離度；方法回收率高于80%，日間和日內RSD<10%，完全符合生物樣品分析要求；可以用于臨床藥物檢測及藥物動力學研究，可作為同行進行抗結核藥物測定的參考。

參考文獻：

[1] World Health Organization.10 Facts about Tuberculosis(March 2009)[EB/OL].http://www.who.int/fearutes/factifiles/tuberculosis/en/.

[2] World Health Organization.“Treatment of Tuberculosis:Guideline for National Programmers”,3rd ed.,2003,Geneva.

[3] 郎美琦,蔣利,黃佳盛.抗結核病藥物治療綜述[J].臨床肺科雜志,2010,15(8):1153-1154.

[4] Calleri E,Lorenzi DE,Furlanetto S,et al.Validation of a RP-LC method for the simultaneous determination of isoniazid,pyrazinamide and rifampicin in a pharmaceutical formulation[J].Pharm Biomed Anal,2002,29(6):1089-1096.

[5] Khuhawar MY,Rind FMA.Liquid chromatographic determination of isoniazid,pyrazinamide and rifampicin from pharmaceutical preparations and blood[J].Chromatogr B,2002,766(2):357-363.

[6] Zhou ZF,Chen LY,Liu P,et al.Stimulatneous deteination of isoniazid,pyrazinamide,rifampicin and acetylisoniazid in human plasma by high-perfomance liquid chromatography [J].Anal Sci,2010,26(11):1133-1138.

[7] Gong Z,Basir Y,Chu D,et al.A rapid and robust liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for simultaneous analysis of anti-tuberculosis drugs-ethambutol and pyrazinamide in human plasma[J].Chromatogr B,2009,877(16):1698-1703.

[8] 譚志榮,陳堯,郭棟,等.HPLC-MS/MS法測定人血漿中西洛他唑濃度[J].中南藥學,2009,7(11):827-830.

[9] 劉艷文,張文淵,顏苗,等.UPLC-MS/MS法測定小鼠血漿及腦組織中馬錢子堿濃度[J].中南藥學,2010,8(5):321-325.