HPLC法測定人血漿中異煙肼、吡嗪酰胺濃度

陸 磊，王 潔，丁紅梓，周秋云，錢智磊，張 亮

0 引言

我國是全球22個結核病高負擔國家之一，世界衛生組織估計，目前我國結核病年發病例數約為130萬，位居全球第二位[1]。同時，我國也是全球27個耐多藥高負擔國家之一[2]。雖然我國在遏制結核病蔓延和流行的實際工作中取得了初步成效，但是要順利實現我國結核病防治規劃目標，仍然面臨著諸多挑戰[3]。

異煙肼(Isoniazid，INH)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA)是用于結核病患者初始治療的重要用藥，大部分患者都可以獲得很好的治療效果[4]。PZA與INH化學結構相似，故可能通過與INH相似的機制破壞肝細胞。有報道，應用INH產生肝毒性的患者聯合應用利福平和PZA后將出現更嚴重的肝損害[5]。INH和PZA的極性相差較小，使用同一流動相同時測定INH和PZA的方法相對簡單，本實驗室建立了同時測定這兩種藥物血藥濃度的方法，現報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜系統(日本島津LC-10A)，包括SCL-10AVP系統控制器、LC-10ADVP溶劑輸送泵、FCV-10ALVP混合器、DGU-14A脫氣機、SPD-10AVP紫外-可見檢測器、CTO-10ASVP柱溫箱、CLASS-VP6色譜工作站；渦旋儀(大龍興利)；分析天平(FB224，上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；酸度計(PHS-3C，上海雷磁)；高速離心機(TG-1650，上海盧湘儀)；艾本德微量移液器(Eppendor，德國)。

1.2 試劑 INH對照品(批號：100578-200401、中國藥品生物制品檢定所)；PZA對照品(批號：100178-200403，中國藥品生物制品檢定所)；甲醇、乙腈(Merck公司，德國)均為色譜純；磷酸二氫鉀、三乙胺(國藥集團，中國)均為分析純。

2 方法和結果

2.1 色譜條件 色譜柱：CLC-ODS(島津，日本，6 mm×150 mm)；柱溫：37 ℃；檢測波長：268 nm；流動相：0.05 mmol/L磷酸二氫鉀(三乙胺調pH=5.6)∶乙腈=96∶4；流速：1 mL/min。

2.2 樣品前處理 精密吸取血清300 μL，置于離心管中，加入700 μL甲醇，放置于渦旋混合儀上混合5 min，以13 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進樣。

2.3 方法特異性 按“2.2”項下方法，處理人空白血漿、對照品溶液+人空白血漿及同時服用INH和PZA的患者血漿。結果INH和PZA的保留時間分別為8.283 min和11.025 min，兩者峰形良好，與雜質峰分離完全。色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖

2.4 標準曲線 取INH和PZA標準液加入空白血漿，使血漿中INH和PZA濃度為0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2 mg/L。按“2.2”項下操作，同法處理血漿。以峰高外標法定量，以濃度對峰面積作直線回歸，最低檢測濃度為0.3 mg/L，見表1。

表1 INH和PZA標準曲線和線性關系結果(n=6)

2.5 回收率 配制低、中、高濃度(1、5、15 mg/L)的含INH和PZA的血漿樣品，每一濃度做平行管3份，按“2.2”項下方法操作進樣，重復進樣6次，記錄峰面積，按回歸方程計算濃度，與標準濃度比較得回收率，結果符合要求，見表2。

表2 加樣回收率測定結果(n=6)

2.6 精密度 配制低、中、高濃度(1、5、15 mg/L)的含INH和PZA的血漿樣品各6份，每一濃度做平行管3份，按“2.2”項下方法操作進樣，分別于同日和3 d內測定，計算日內、日間RSD。精密度符合要求，結果見表3。

表3 日內、日間精密度計算結果(n=6)

2.7 穩定性 配制低、中、高濃度(1、5、15 mg/L)的含INH和PZA的血漿樣品，每一濃度做平行管3份，于室溫(20～30 ℃)放置0、4、8 h后，測定血漿樣品濃度，每個樣品重復測定6次；再取高、中、低濃度的INH和PZA的血漿樣品，于-20 ℃放置7、14 d后，測定血漿樣品濃度，每個樣品重復測定6次。結果表明，樣本在室溫8 h、反復凍融3次和在-20 ℃放置14 d的條件下保持穩定。

3 討論

3.1 樣品前處理 通過固相萃取、液-液萃取、吹干復溶等樣品前處理方法的比較，最后選擇甲醇沉淀后直接進樣的方法，該方法較固相萃取法成本大大降低，同時具有較高的回收率，而采取吹干復溶法雖然可以提高檢測靈敏度，但其耗時且費用較高，不利于臨床廣泛開展。在比較甲醇和乙腈沉淀蛋白的效果后，發現乙腈雖在1∶1用量時具有很好的沉淀效果，但由于流動相中使用乙腈，進樣時會造成色譜圖形變化，產生拖尾、偏峰。

3.2 流動相選擇 本實驗室在測定單組分異煙肼時使用0.05 mmol/L磷酸二氫鉀(三乙胺調pH=5.6)∶乙腈=98∶2[6-7]，該比例可以滿足同時測定INH和PZA，但測定時間超過15 min，通過多次嘗試后發現，將磷酸二氫鉀和乙腈比例調整至96∶4時，既可以避免血漿中雜質峰干擾，又能將吡嗪酰胺的出峰時間前移約4 min，節約測定時間。

3.3 檢測方法評價 該方法相較于單次測定每種抗結核藥的血藥濃度，可以節約1/2的成本和時間，同時具有很好的穩定性和重現性，通過與單獨測定相同樣本INH和PZA的血藥濃度比較，該方法結果可靠，可以用于臨床樣本檢測。

參考文獻：

[1] World Health Organization.Global tuberculosis control:WHO report 2010.WHO/HTM/TB/2010.7.Geneva:WHO,2010.

[2] Stop TB Partnership.Global MDR-TB&XDR-TB response plan.2007-2008[M].Geneva:World Health Organization,2007:19.

[3] 全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組,全國結核病流行病學抽樣調查辦公室.2010年全國肺結核患病率現況調查[J].中華結核和呼吸雜志,2012,35(9):665-669.

[4] 田洪英,王洪星,姚明.抗結核藥血藥濃度監測及臨床療效與安全性分析[J].中國藥房,2012,23(26):92-94.

[5] Saukkonen JJ,Cohn DL,Jasmer RM,et al.An official ATS statement:hepatotoxicity of antituberculosis therapy[J].Am J Respir Crit Care Med,2006,174(8):935-952.

[6] 許亦鳴,陳冰,王潔,等.高效液相色譜法測定人血漿中異煙肼及乙酰異煙肼濃度[J].中國藥房,2005,16(13):41-43.

[7] 楊書華,王潔,朱文玉,等.難治性結核性胸腔積液中異煙肼濃度的檢測和對比[J].臨床肺科雜志,2013,18(3):54-55.