針灸內關預處理對心肌缺血再灌注損傷兔血清NO、NOS及腺苷含量的影響*

陽晶晶 嚴 潔 王 超△ 常小榮 劉 密

林海波2 謝文娟1 賀香嫦1 張佳麗1 劉 昭1

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.廣東省五邑中醫院，廣東 江門 529000）

針灸內關預處理對心肌缺血再灌注損傷兔血清NO、NOS及腺苷含量的影響*

陽晶晶1嚴 潔1王 超1△常小榮1劉 密1

林海波2謝文娟1賀香嫦1張佳麗1劉 昭1

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.廣東省五邑中醫院，廣東 江門 529000）

目的 觀察針灸內關預處理對心肌缺血再灌注損傷兔血清一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）及腺苷含量的影響。方法 將32只新西蘭大耳白兔隨機分為假手術組、缺血再灌注組、電針組和艾灸組。采用結扎左冠狀動脈前降支40 min再灌注60 min的方法，建立心肌缺血再灌注損傷模型。假手術組于末次捆綁結束48 h后開胸，穿線靜置40 min，拔線，繼續靜置60 min后取材；缺血再灌注組于末次捆綁結束后48 min行缺血再灌注后取材，電針組和艾灸組分別在針刺、艾灸內關穴之后48 h再行缺血再灌注。高效液相色譜法測定血清腺苷含量，采用硝酸還原酶化學比色法檢測血清NO、NOS的含量。結果 缺血再灌注組血清NO、NOS及腺苷的含量較假手術組相比明顯下降（P＜0.05）；電針組與艾灸組血清NO、NOS及腺苷的含量較缺血再灌注模型組相比均明顯升高（P＜0.01），而電針組與艾灸組兩組間無明顯差異（P＞0.05）。結論 電針、艾灸內關穴預處理可以提高兔血清中NO、NOS及腺苷的含量，即可以增強延遲性保護機制的細胞信號轉導通路中觸發物質NO、NOS、腺苷的活性和含量，表明了針灸預處理內關穴可以在48 h這一延遲時相產生針對缺血再灌注損傷心肌的保護作用。

針灸預處理 心肌缺血再灌注損傷 內關 NO NOS 腺苷

目前，缺血性心臟病的發病率呈逐年上升趨勢，缺血性心血管病占我國心血管病總發病數的65%［1］。缺血性心臟病的治療關鍵是以恢復冠脈灌注為核心。研究發現，冠脈的驟然開通與血流恢復，會引起心肌缺血再灌注損傷（MIRI）。本課題組早在前期做了大量研究工作，證實了針灸預處理能夠通過多種途徑對大鼠、家兔MIRI起到保護作用［2-8］。本實驗以心肌缺血再灌注兔為模型，通過對延遲性保護機制的細胞信號轉導通路中觸發物質一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、腺苷的活性和含量的比較，觀察針灸內關預處理對MIRI的延遲保護作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源及分組 選用新西蘭大耳白兔共32只，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供（清潔級），每只分籠圈養于動物中心實驗室。體質量1.5～2.5 kg，月齡3～4個月，雌雄兼用，飼養溫度20～25℃，濕度50%～70%。分組采用完全隨機方法，將其分為假手術組，缺血再灌注組，電針組，艾灸組，每組各8只。

1.2 干預方法 （1）假手術組。將兔捆綁固定于兔臺上，每次20 min，每日1次，連續5 d。于末次捆綁結束后48 h按缺血再灌注造模的起始流程開胸，穿線靜置40 min，拔線，繼續靜置 60 min后取材。（2）缺血再灌注組。將兔捆綁固定于兔臺上，每次20 min，每日1次，連續5 d。于末次捆綁結束后48 h行缺血再灌注后取材。（3）電針及艾灸組。將兔捆綁固定于兔臺上之后，相應行電針、艾灸預處理，每次20 min，每日1次，連續5 d。于末次捆綁結束后48 h行缺血再灌注后取材。

1.3 模型制備 兔稱質量后經耳緣靜緩慢推注20%烏拉坦（4 mL/kg）作全身麻醉，麻醉成功后繼續經耳緣靜脈緩慢滴入5%葡萄糖注射液。將兔仰位固定在兔臺上，左胸前區去毛，碘伏皮膚消毒，鋪無菌洞巾；將心電圖肢導聯的針形電極刺于兔皮下，紅色電極與右上肢相連，黃色電極與左上肢相連，綠色電極與左下肢相連，標準電壓為10 mm/mv，走紙速度為50 mm/s；沿胸骨正中線左側旁開1～2 cm處切開皮膚，切口約5 cm，顯露肋骨，從第3、4肋間隙處鉗夾預防出血后，剪斷上下兩肋，以乳突牽開器適度撐開胸壁，此時可見心臟；用無齒鑷夾住已被剪開的心包膜，將心臟輕輕向上提起，以左冠狀動脈主干為標志，再用持針器持無創性小圓彎針在左冠狀動脈前降支上、中1/3交界處穿一根零號醫用縫合線，將縫合線兩端套入一直徑為2 mm長度為3 cm的硅膠管，用止血鉗將硅膠管送入緊貼心壁，連絲線一起夾緊后即為結扎血管；立即心電圖監測，以左室前壁發紺及心電圖ST段抬高為缺血達成的標志，合攏胸腔，生理鹽水紗塊覆蓋切口，持續結扎40 min后開胸，松開止血鉗以釋放硅膠管，恢復左前降支灌流60 min。

1.4 針灸操作 將兔固定于兔臺上后，電針組采用華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針療儀 （蘇州醫療用品有限公司）電針雙側內關穴，直刺入穴位約0.5 cm，行小幅度捻轉手法（平補平瀉）1 min后接電針（內關穴接刺激較強的負極，正極接兔尾部）。刺激參數：疏密波，疏波10 Hz，密波50 Hz，強度以雙上肢輕微顫動為度。艾灸組采用“神灸300灸”艾柱（每壯含艾絨約0.2 g，蘇州東方艾絨廠生產）灸兔雙側內關穴，以上均操作時間20 min，每日1次，共5 d。

1.5 標本采集與檢測 動物經歷缺血40 min、再灌注60 min后，兔頸部去毛沿氣管正中線切開皮膚，將一側頸動脈行鈍性分離，用2支6 mL無抗凝劑的真空采血管取頸動脈血各3 mL，3000 r/min離心10 min分離血清，移液槍分別吸取上清0.5 mL至Eppendorf離心管內，-20℃冰箱凍存，采用硝酸還原酶化學比色法檢測血清NO、NOS的含量，高效液相色譜法測定血清腺苷含量。

1.6 統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件。計量資料以（±s）表示。所有數據進行正態性檢驗，滿足正態性時，采用單因素方差分析。組間比較若方差齊時采用LSD法檢驗，方差不齊時用Tamhane’s T2法檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組MIRI兔血清中NO、NOS含量的比較 見表1。缺血再灌注組血清NO、NOS的含量較假手術組相比明顯下降（P＜0.05）；電針組與艾灸組血清NO、NOS的含量較缺血再灌注模型組相比均明顯升高 （P＜0.01），而電針組與艾灸組兩組間無明顯差異 （P＞0.05）。以上結果提示，電針、艾灸內關穴預處理可以使心肌缺血再灌注損傷兔血清中NO的含量升高，NOS的活性增強。

表1 各組兔血清中NO、NOS、腺苷含量比較（±s）

表1 各組兔血清中NO、NOS、腺苷含量比較（±s）

與假手術組相比，△P＜0.05；與缺血再灌注組相比，▲P＜0.01。

組 別 n 腺苷（ng/mL）NO（μmol/L） NOS（μmol/L）電針組 8 131.11±18.33▲艾灸組 8 131.76±27.89▲缺血再灌注組 8 82.62±13.85△30.18±3.71▲ 30.2±2，46▲32.86±4.30▲ 30.03±2.06▲24.08±1.14△ 24.62±1.72△假手術組 8 107.28±5.24 27.58±3.25 27.21±1.73

2.2 針灸內關預處理對MIRI兔血清腺苷含量的影響見表1。缺血再灌注組血清腺苷的含量較假手術組相比明顯下降（P＜0.05）；電針組與艾灸組血清腺苷的含量較缺血再灌注模型組相比均明顯升高（P＜0.01），而電針組與艾灸組兩組間無明顯差異（P＞0.05）。以上結果提示，電針、艾灸內關穴預處理可以使心肌缺血再灌注損傷兔血清中腺苷的含量升高。

3 討 論

NO和NOS在心肌缺血再灌注損傷中有重要作用［9］。NO是一種生物活性分子，不僅參與了對冠脈血管舒縮的調控，維持有效的冠脈循環血流，而且對缺血后心肌的轉歸及心肌功能的恢復可能起著重要的作用。當心肌發生MIRI損傷時，明確缺血心肌處NO變化規律及NO對心肌功能的影響有著重要臨床意義。NOS為一含鐵的單氧化酶，心肌中的NOS是NO的限速酶，其同功酶的活性影響著NO的生物效應［10］。Johnson等最早提出NO可減輕心肌缺血再灌注損傷［11］。心肌缺血性損傷時cNOS mRNA呈低表達，NOS活性降低，心肌NO的合成和釋放減少，血清NO濃度下降［12-13］。

腺苷是體內一種內源性嘌呤核苷酸，是ATP降解過程中的中間產物。在冠狀動脈的自動調節中發揮重要作用。腺苷具有廣泛的心血管效應，能夠抑制內皮素和去甲腎上腺素釋放，擴張冠脈，抑制血小板凝集，保護微血管結構，減少中性粒細胞激活，減緩能量消耗，刺激糖酵解，減少超氧陰離子產生。腺苷為一種內源性抗炎物質，可以降低腫瘤壞死因子-α的合成，而腫瘤壞死因子-α是IR損傷作用的主要炎癥介質［15］，從而起到抗炎作用，保護心肌。

本實驗選用的是內關穴，為手厥陰心包經之絡穴，又為八脈交會穴，通于陰維脈，手厥陰心包經起于胸中，出屬心包絡，向下通過橫膈，從胸至腹依次聯絡上、中、下三焦，主治心痛、胸悶、心煩等疾患。心包絡為心“臣使之官”，代心受其損，心主血脈，又主神明，故內關穴可治療心疾血證。《針灸甲乙經》云“實則心暴痛，虛則心煩，心惕惕不能動，失智，內關主之”。《難經》曰“陰維為疾苦心痛”。《針灸縫源》云“治心暴痛，支滿肘攣，瘧疾氣短”。后人又總結出“心胸內關謀”，都說明了內關穴對治療心臟疾病具有特異性。

大量的動物實驗證明電針內關穴對大鼠、兔心肌缺血再灌注具有保護作用，而這類的研究多集中在針刺的即時保護效應，而針刺的延遲保護作用則較為偏少。易受鄉等發現，針刺內關穴對心肌缺血具有24 h后的延遲保護作用［8］。 基于缺血預適應（IP）的“第二保護窗”其時間長達 24～72 h［16］，故本實驗選定觀察針灸后48 h是否具有延遲保護作用。值得重視的是，目前對于心肌缺血治療大多集中在針刺，而對于艾灸的研究不多見，故本實驗設立的艾灸組，有利于艾灸治病防病的推廣，擴大針灸的應用范圍。本研究通過對兔實行連續5 d電針、艾灸內關穴預處理，48 h后再造模取材，對內源性保護物質血清NO、NOS和腺苷含量的測定，來判斷針灸內關預處理對心肌的延遲保護效應。實驗結果證實電針、艾灸內關穴預處理可以提高兔血清中NO、NOS及腺苷的含量，即可以增強延遲性保護機制的細胞信號轉導通路中觸發物質NO、NOS、腺苷的活性和含量，表明了針灸預處理內關穴可以在48 h這一延遲時相表達出針對缺血再灌注損傷的心肌保護作用。本實驗研究結果可以為“心胸內關謀”理論提供實驗依據，有利于針灸“治未病”在臨床的推廣。

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［4］田岳鳳，易受鄉，嚴潔，等.電針內關穴對心肌缺血-再灌注損傷預防保護作用的實驗研究（Ⅱ）——對超微結構及細胞凋亡的影響［J］.中國中西醫結合急救雜志，2002，9（1）：15-18.

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The Effect of Acupuncture at Neiguan（PC6） Pretreatment on the Expression of Blood Serum NO，NOS，and Adenosine in Rabbits with MIR

YANG Jingjing，YAN Jie，WANG Chao，et al.Hunan University of Chinese Medicine，Hunan Changsha410208，China

Objective:To observe the effect of acupuncture at Neiguan （PC6） pretreatment on the expression of NO，NOS，and adenosine.Methods:32 New Zealand big-ear rabbits were randomly divided into 4 groups:shamoperation group，ischemia reperfusion group，electric acupuncture preconditioning group and moxibustion pretreatment group.Myocardial ischemia-reperfusion injury model was established by the method of Ligating the anterior descending branch of the left coronary artery for 40 min and then reperfusing for 60 min.After the last bunding for 48 h，rabbits in sham-operation group were chest-opened，threaded and standed for 40 min，then the line was pulled out and standed for 60 minutes，then samples were selected.After the last bunding for 48 mins，rabbits in ischemia reperfusion group were conducted ischemia-reperfusion，then samples were selected；rabbits in electric acupuncture preconditioning and moxibustion pretreatment group were acupunctured at Neiguan （PC6） acupoint respectively.After that for 48 h，ischemia-reperfusion was conducted.Serum adenosine content was determined by high performance liquid chromatography；the content of serum NO and NOS was determined by ELISA method.Results： NO，NOS，and adenosine contents of ischemia-reperfusion group decreased significantly than those of control sham-operation group with statistical difference （P＜0.05）；NO，NOS，and adenosine contents of electric acupuncture preconditioning and moxibustion pretreatment group increased significantly than those of control ischemia-reperfusion group with obviously statistical difference （P＜0.01），but there was no significantly difference between electric acupuncture preconditioning and moxibustion pretreatment group（P＞0.05）.Conclusion： Electric acupuncture pretreatment and moxibustion pretreatment can increase the release of endogenous protection materi-als in serum of MIRI rabbits such as NO，NOS，and adenosine，which indicates the protective effect of acupuncture at Neiguan（PC6） pretreatment on ischemical reperfusion injury in 48 h.

Acupuncture pretreatment；MIR；Neiguan（PC6） acupoint；NO；NOS；Adenosine

R246

A

1004-745X（2014）07-1209-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.07.001

國家自然科學基金項目（81072868）；國家自然科學基金青年項目（81102661）；中國中醫科學院自主開放項目（ZZKF06008）；湖南省研究生科研創新項目（CX2011B338）；浙江省“重中之重”學科開放基金項目（ZTK2010B05）；湖南省教育廳課題（08C633）；湖南省教育廳課題項目（2013sk3086）

△通信作者

2014-02-31）