脫氫紫堇堿對內毒素血癥大鼠心肌NF-κB和SOD、MDA的影響*

周晶晶 黃小民 蔣旭宏△ 李 杏

（1.浙江中醫藥大學附屬第一醫院，浙江 杭州 310006；2.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310006）

脫氫紫堇堿對內毒素血癥大鼠心肌NF-κB和SOD、MDA的影響*

周晶晶1黃小民1蔣旭宏1△李 杏2

（1.浙江中醫藥大學附屬第一醫院，浙江 杭州 310006；2.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310006）

目的 觀察脫氫紫堇堿（DHC）對內毒素血癥大鼠心肌核因子-κB（NF-κB）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的影響，探討DHC對內毒素血癥大鼠心肌損傷的保護作用及其機制。方法 采用直接尾靜脈注射內毒素的方法建立大鼠內毒素血癥心肌損傷模型，50只Wistar大鼠隨機分成5組：NS對照組、LPS模型組、DHC低劑量組、DHC中劑量組、DHC高劑量組。采用比色法檢測血清SOD含量、TBA法測定血清含量，免疫組化組檢測心肌組織NF-κB的表達。結果 LPS模型組大鼠血清SOD含量明顯減低，而MDA含量明顯增高，心肌組織中NF-κB蛋白水平明顯增高，與NS對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；予DHC干預后，DHC低、中劑量組可明顯使降低的SOD活性升高，而高劑量組與LPS模型組差異無統計學意義（P＞0.05）；DHC各劑量組可明顯降低血清MDA含量，與LPS模型組相近（P＜0.01）；DHC各劑量組大鼠心肌組織NF-κB蛋白水平明顯下降，與LPS模型組比較差異明顯（P＜0.01）。結論 DHC可以通過降低內毒素血癥大鼠心肌組織內NF-κB活性和提高大鼠抗氧化能力，對心肌產生保護作用。

內毒素血癥 脫氫紫堇堿 NF-κB SOD MDA

內毒素血癥通常導致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、彌漫性血管內凝血等，病死率極高。脫氫紫堇堿（DHC）是中藥延胡索塊莖中的有效提取物，臨床常用于心血管疾病的治療。筆者既往研究發現內毒素血癥早期即可出現心肌損傷，而DHC對其炎癥反應有明顯抑制作用，可以保護受損的心肌組織。本研究擬進一步觀察DHC對內毒素血癥大鼠核因子-κB（NF-κB）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的影響，從而探討DHC對內毒素大鼠心肌損傷保護機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 清潔級雄性Wistar大鼠50只由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，體質量200～220 g，SPF級。脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司試劑，批號：H20055058；DHC為大連美侖生物技術有限公司產品，批號：20120510；SOD （批號：20130622）、MDA （批號：20130406）檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司；NF-κB p65抗體購自美國Santa Cruz公司，免疫組織化學兩步法試劑盒、濃縮型DAB試劑盒（ZLI-9032）為北京中杉金橋公司產品。

1.2 造模及給藥 50只Wistar大鼠在實驗室分籠飼養1周，室溫維持25℃，自由進食、飲水。以隨機數字表法將大鼠分為5組：NS對照組、LPS模型組、DHC低、中、高（2.5、5、10 mg/kg）劑量組，每組 10 只。 LPS 模型組和DHC低、中、高劑量組大鼠分別經尾靜脈注入內毒素5 mg/kg，NS對照組給予等容積生理鹽水。在靜脈注完內毒素后，DHC低、中、高劑量組大鼠再經尾靜脈分別注入DHC溶液2.5、5、10 mg/kg。NS對照組、LPS模型組給予等容積生理鹽水，方法同DHC干預組。

1.3 標本采集與檢測 給藥1 h后予25%的水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹主動脈取血，分離血清，采用比色法檢測血清SOD含量、TBA法測定血清含量，操作嚴格按照試劑盒說明書；取左心室心肌組織，以10%甲醛固定，NF-κB的蛋白表達檢測采用免疫組化法兩步法，心肌組織石蠟切片經常規脫蠟至水，高壓熱修復后予3%H2O2溶液阻斷內源性過氧化物酶10 min；PBS洗5 min×3次；滴加一抗，37℃孵育 60 min；PBS洗5 min×3次；滴加二抗，37℃孵育 60 min；PBS洗 5 min×3次；DAB顯色、復染、脫水透明后封片。陽性者表現為心肌胞漿內棕黃色顆粒沉積，染色完成后，進行400倍的顯微照相和MetaMorph/BX41型圖象數據分析系統測定積分吸光度，進行數據分析。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，各組均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清SOD、MDA含量比較 見表1。LPS模型組大鼠血清SOD含量明顯減低，而MDA含量明顯增高，與NS對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；DHC低、中劑量組SOD水平升高，而高劑量組與LPS模型組相近；DHC各劑量組血清MDA含量均明顯降低，與LPS模型組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 各組大鼠心肌組織NF-κB的表達比較 見表1，圖1。LPS模型組大鼠心肌組織中NF-κB蛋白水平明顯增高，與NS對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），而DHC低、中、高劑量均能使心肌組織中NF-κB蛋白水平明顯下降，與LPS模型組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

表 1 血清 SOD、MDA、含量變化（±s）

表 1 血清 SOD、MDA、含量變化（±s）

與LPS模型組比較，*P＜0.01。

組 別 n NF-κB（MOD）NS對照組 10 0.16±0.060*LPS模型組 10 0.35±0.014 DHC 低劑量組 10 0.26±0.010*SOD（U/mL） MDA（nmol/mL）179.41±4.82* 3.29±0.34*136.88±4.27 7.04±0.21 158.73±3.45* 4.85±0.43*DHC 中劑量組 10 0.22±0.015*165.58±6.25* 4.37±0.34*DHC 高劑量組 10 135.88±2.34 6.33±0.19* 0.31±0.023*

圖1 各組大鼠心肌組織NF-κB的表達

3 討 論

近年來，大量研究表明氧化應激是導致心血管系統結構功能異常的重要原因之一。內毒素血癥過程中，單核巨噬細胞在收到病原體刺激后，產生呼吸爆發，可以產生大量活性氧（ROS）。ROS是指由氧化還原反應產生，具有化學性質活潑的含氧功能基團的化合物，其參與生成ONOO-及 H2O2，ONOO-可激活核聚酶聚合酶，從而造成心肌收縮力的下降［1］。MDA是機體脂質過氧化代謝的毒性產物，是判斷自由基損傷的重要指標。測定組織MDA含量可估計組織脂質過氧化損傷程度和氧自由基的生成情況，而SOD是體內最重要的自由基清除劑之一，能夠催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，消除體內自由基鏈式反應對機體的損害，減輕自由基鏈式反應對機體的損害。NF-κB是一類能與多種基因啟動子部位的κB位點特異結合，并促進轉錄的蛋白質總稱，靜息狀態下通過I-κB緊密結合以無活性的形成存在于細胞漿中，對細胞的生長、分化、黏附、凋亡及炎癥反應等具有十分重要的調節作用［2］，NF-κB是第一個被證明能被ROS激活的真核細胞轉錄因子，并且兩者之間存在正反饋效應［3］。內毒素血癥發生時，NF-κB亦能被LPS刺激激活，刺激信號可使I-κB磷酸化，從而與NF-κB解離，研究顯示LPS刺激后可在1h內引起NF-κB的大量激活［4-5］，激活后的NF-κB能誘導表達血管內皮細胞黏附分子和腫瘤壞死因子，這些細胞因子可直接引起血管內皮細胞和心肌細胞的損傷。

本研究采用尾靜脈注射LPS建立內毒素血癥大鼠模型，不同劑量DHC進行干預，研究結果顯示，DHC低、中、高各劑量均可明顯降低血清MDA含量，降低心肌組織中NF-κB含量，與模型組相比差異明顯（P＜0.01），中、高劑量DHC可顯著升高SOD活性，而高劑量組與模型組水平相近。因此筆者認為DHC可能是通過降低大鼠氧化應激，增加SOD活性，保護自由基清除系統，減輕脂質過氧化反應及有害代謝產物對心肌細胞的損傷，并且聯合調控NF-κB活化，降低NF-κB活性，抑制細胞因子激活，從而減輕炎癥反應，減輕細胞因子對心肌細胞的損傷，達到對內毒血癥大鼠心肌保護作用。

［1］Francisco G Soriano，Antonio C．Nogueira，et al.Potential role of poly （adenosine 5′-diphosphate-ribose）polymerase activation in the pathogenesis of myocardial contractile dysfunction associated with human septic shock［J］．Crit Care Med，2006，34（8）：1073-1079.

［2］Clermonte，vrgelyc V，Girard C，et al.Cellula rinjury accoiated with extracorporeal circulation［J］.Ann Catdiol Angeiol（Paris），2002，51（12）：3843-3846.

［3］游琪，蔡久英.氧化應激與心肌損傷的研究進展［J］.臨床薈萃，2005，20（19）：1127-1128.

［4］羅斌，張斌，何韻，等.大鼠急性心肌缺血后心肌NF-kB的檢測及其法醫學意義［J］.中國法醫雜志，2005，20（5）：257-259.

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Influence of Dehydeocorydaline on the Expression of NF-κB，SOD，and MDA in Myocardium of Rats with Endotoxemia

ZHOU Jingjing，HUANG Xiaomin，JIANG Xuhong，et al.The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medicine University，Zhejiang，Hangzhou310006，China

Objective:To study the influence of dehydeocorydaline on the expression of NF-κB，SOD，and MDA in myocardium rats with endotoxemia，and to investigate protective mechanism of DHC on myocardial injury model．Methods： Tail intravenous injection of endotoxin was used to establish myocardial injury model in rats with endotoxemia.50 male Wistar rats were randomly divided into 5 groups:NS control group，LPS model group，DHC low dose group，DHC medium dose group，and DHC high dose group.Colorimetry was applied to detect the contents of serum SOD，Total Bile Acids method to detect the content of serum MDA，and immunohistochemical SP method to detect myocardial tissue NF-κB.Results： Serum SOD content in LPS model group significantly reduced，MDA content obviously increased，and NF-κB protein levels in myocardial tissue significantly increased.Compared with NS control group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.After DHC intervention，activities of SOD in DHC low，middle dose groups obviously increased，but difference of high dose group had no statistical significance with that of LPS model group.Serum MDA content obviously reduced in each DHC dose group，and there were significant differences compared with LPS model group （P＜0.01）.NF-κB protein levels in each DHC dose group significantly decreased.Compared with LPS model group，the difference was statistically significant （P＜0.01）.Conclusion： DHC can reduce activity of NF-κB in myocardial tissue of rats with endotoxemia and improve the antioxidant ability to protect myocardium.

Endotoxemia；Dehydeocorydaline；NF-κB；SOD；MDA

R285.5

A

1004-745X（2014）07-1231-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.07.009

浙江省中醫藥管理局項目（2011za034）

△通信作者

2014-04-08）