不同碳氮源對(duì)一株產(chǎn)油小球藻油脂積累的影響

金 虹， P.K.Andy Hong， Diana Bao， 呂海棠， 李文林， 馬明英

(1.青海大學(xué) 化工學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 猶他大學(xué) 土木與環(huán)境工程系，美國(guó) 鹽湖 84112)

不同碳氮源對(duì)一株產(chǎn)油小球藻油脂積累的影響

金 虹1， P.K.Andy Hong2， Diana Bao2， 呂海棠1， 李文林1， 馬明英1

(1.青海大學(xué) 化工學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 猶他大學(xué) 土木與環(huán)境工程系，美國(guó) 鹽湖 84112)

以蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)為研究對(duì)象,考察了不同碳源及氮源對(duì)小球藻生物量和油脂產(chǎn)率的影響,確定了最佳碳源和氮源的添加量.結(jié)果表明，蛋白核小球藻最優(yōu)碳源是葡萄糖，最優(yōu)氮源是尿素；當(dāng)葡萄糖濃度為30mg/L、尿素濃度為1.5mg/L時(shí)，小球藻生物量和油脂產(chǎn)率達(dá)到8783.9mg/L和126.3mg/L/d，比優(yōu)化前分別提高了37.9%和125%.這為今后培養(yǎng)小球藻，提高其生物量和油脂產(chǎn)率奠定了一定的理論基礎(chǔ).

蛋白核小球藻；碳源；氮源；生物量；油脂產(chǎn)率

隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，開發(fā)可持續(xù)生產(chǎn)的化石燃料替代燃料成為未來燃料發(fā)展的主導(dǎo)方向，而生物燃料是化石燃料替代燃料的首選之一.在目前人類開發(fā)的生物燃料中，生物柴油占有重要地位，但生物柴油商業(yè)化的主要障礙是原料供應(yīng)的不足.所以，為促進(jìn)生物柴油工業(yè)化的可持續(xù)發(fā)展，需要加快開發(fā)新的、非食用性、產(chǎn)量更高、生產(chǎn)周期更短、生產(chǎn)成本更低、土地使用更少的原料[1].而藻類的高生產(chǎn)率、高油脂含量及不會(huì)占用人類食物和生產(chǎn)用地等特點(diǎn)都顯示出藻類生物質(zhì)有被用于生物燃料生產(chǎn)的巨大潛力[2-5].但微藻培養(yǎng)的成功與否，需要考慮各種影響微藻生物質(zhì)產(chǎn)率的因素.如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、溫度、pH、光照強(qiáng)度等等.據(jù)研究[6-7]，微藻在異養(yǎng)或外源性碳源提供化學(xué)能條件下生存時(shí)，細(xì)胞通常儲(chǔ)存油滴，同時(shí)，氮也是微藻生物質(zhì)生產(chǎn)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而碳氮源的數(shù)量、可利用性和類型都會(huì)在不同程度影響微藻的生物質(zhì)量和油脂積累[8-9].本研究從不同碳氮源類型、濃度及碳氮源優(yōu)化環(huán)境觀察對(duì)小球藻生物質(zhì)量和油脂產(chǎn)率的影響.

1 材料與方法

1.1藻種及培養(yǎng)基

蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa),中國(guó)科學(xué)院青島生物能源研究所贈(zèng)送，經(jīng)BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)后，其生物量和油脂產(chǎn)率分別可達(dá)6372mg/L、71.4mg/L/d、油脂含量達(dá)到16.8%.

培養(yǎng)基：BG11培養(yǎng)基及添加不同碳源、氮源的BG11培養(yǎng)基.

1.2培養(yǎng)方法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子培養(yǎng)液以10%(V/V)接種量接種于各相應(yīng)培養(yǎng)基，試驗(yàn)在裝有300mL培養(yǎng)基的500mL三角瓶中進(jìn)行，每個(gè)樣品做3個(gè)平行.置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照周期為16:8h，培養(yǎng)溫度與光照強(qiáng)度分別為：28℃、3500lx，每天搖瓶3-5次，隨機(jī)變換三角瓶的位置.同時(shí)，定期取樣鏡檢，確定小球藻正常生長(zhǎng)及有無雜菌污染.

1.3分析方法

1.3.1 生物量的測(cè)定 用移液器移取3mL待測(cè)藻液于1cm比色皿中，以無菌培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每天定時(shí)用紫外可見分光光度儀測(cè)定藻液在750nm處的吸光值[10]，每個(gè)樣品測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，繪制生長(zhǎng)曲線.指數(shù)生長(zhǎng)末期收獲，于5000r/min離心10min，棄上清液，滅菌蒸餾水清洗藻泥，重復(fù)3次.經(jīng)真空冷凍干燥，用精密分析天平稱量藻粉重量，并計(jì)算單位體積生物量.

1.3.2 總脂含量的測(cè)定 將冷凍干燥藻粉與石英砂按重量1:3比例混合，置于研缽中充分研磨后，加入氯仿甲醇混合劑(氯仿∶甲醇∶水的體積比為1:2:0.8)振蕩5min，靜置15min后6000 r/min離心2min，收集上層提取液.下層沉淀再重復(fù)上述操作2次，合并3次提取液，加入氯仿，使氯仿、甲醇、水的最終體積比為1:1:0.9，振蕩30s后靜置分層，收集氯仿層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒重，稱取油脂重量[9]，并計(jì)算油脂含量和油脂產(chǎn)率.

油脂含量=所得油脂重量/藻粉重量×100%

油脂產(chǎn)率=藻粉重量×油脂含量/T(T為培養(yǎng)天數(shù)).

所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS16.0軟件和Excell2007處理后作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1不同碳源對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)速率及油脂產(chǎn)率的影響

將蛋白核小球藻接種在濃度分別達(dá)到15g/L的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、醋酸鈉的BG11液體培養(yǎng)基中.其生長(zhǎng)情況如圖1所示，小球藻在幾種環(huán)境中均可以生長(zhǎng)，而且各平行環(huán)境之間的生長(zhǎng)無顯著差異(P>0.05).但在添加葡萄糖的環(huán)境中遲緩期更短，對(duì)數(shù)期更長(zhǎng)，其吸光度值增加更快，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期其吸光值增長(zhǎng)至2.63，明顯高于其他幾個(gè)環(huán)境.經(jīng)過測(cè)定生物量和油脂產(chǎn)率，在添加葡萄糖的環(huán)境中其生物量和油脂產(chǎn)率均為最高,分別為8274.6mg/L和119.7mg/L/d，醋酸鈉環(huán)境中最低，分別為6432.6mg/L和74.4 mg/L/d，且差異性顯著.但該小球藻在四種添加碳源的環(huán)境中油脂產(chǎn)率均有不同程度的提高.可見，添加一定種類和濃度的碳源有利于小球藻油脂的積累.這與賀國(guó)強(qiáng)[11]等的研究結(jié)果一致.見圖2所示.本實(shí)驗(yàn)選擇葡萄糖作為該小球藻的最佳碳源.

圖1 蛋白核小球藻在不同碳源環(huán)境中的生長(zhǎng)曲線Figure 1 Growth curves of Chlorella pyrenoidosa and lipid productivity of with different carbon sources

圖2 蛋白核小球藻在不同碳源環(huán)境中的生物量和油脂產(chǎn)率Figure 2 The biomass Chlorella pyrenoidosa under different carbon sources

2.2不同氮源對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)速率及油脂產(chǎn)率的影響

圖3 蛋白核小球藻在不同氮源環(huán)境中的生長(zhǎng)曲線Figure 3 Growth curves of Chlorella pyrenoidosas with different nitrogen sources

圖4 蛋白核小球藻在不同氮源環(huán)境中的生物量和油脂產(chǎn)率Figure 4 The biomas and lipid productivity of Chlorella pyrenoidosa under different nitrogen sources

將蛋白核小球藻分別接種在使氮元素濃度為0.25g/L即氯化銨、硝酸鈉、硫酸銨、尿素濃度分別達(dá)到0.95g/L、0.25g/L、1.35g/L、0.5g/L的BG11培養(yǎng)基中，并與未加任何氮源的條件比較，其生長(zhǎng)情況如圖3所示，蛋白核小球藻在四種條件中的生長(zhǎng)情況均好于未加氮源的環(huán)境，且各平行實(shí)驗(yàn)間無顯著差異(P>0.05)，但小球藻在尿素環(huán)境中生長(zhǎng)最好，在培養(yǎng)末期吸光度值最高達(dá)到2.18，而氯化銨環(huán)境才達(dá)到1.02，而且尿素環(huán)境中顏色更綠，細(xì)胞密度更大，細(xì)胞活力更強(qiáng).說明氮源是微藻生長(zhǎng)所必需的，但微藻對(duì)不同氮源的吸收及利用程度不同[12].同時(shí)從生物量和油脂產(chǎn)率來看，在添加尿素的環(huán)境中，其生物量和油脂產(chǎn)率分別達(dá)到7168.4mg/L和105.6mg/L/d，明顯高于添加氯化銨的3216.7mg/L、33.6 mg/L/d，同時(shí)也高于添加硝酸鈉和硫酸銨及未添加氮源的培養(yǎng)環(huán)境，且差異性顯著.如圖4所示.所以，選擇尿素為該小球藻的最佳氮源.

2.3不同碳氮組合對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)速率及油脂產(chǎn)率的影響

圖5 蛋白核小球藻在不同碳氮組合下的生物量和油脂產(chǎn)率Figure 5 The biomass and lipid productivity of Chlorella pyrenoidosa with different combination of carbon and nitrogen sources

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論，以BG11培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對(duì)葡萄糖和尿素進(jìn)行3個(gè)水平組合的兼養(yǎng)培養(yǎng).結(jié)果如圖5所示.隨著葡萄糖和尿素濃度的增加該小球藻生物量也逐漸增加，當(dāng)葡萄糖、尿素濃度分別達(dá)到30mg/L和1.5mg/L時(shí)，生物量達(dá)到最大的8783.9mg/L，油脂產(chǎn)率也達(dá)到最大為126.3mg/L/d，生物量和油脂產(chǎn)率分別比其自養(yǎng)環(huán)境提高37.9%和125%.各平行實(shí)驗(yàn)間無顯著差異(P>0.05).這與微藻在兼養(yǎng)條件下較自養(yǎng)時(shí)可積累更多的油脂的研究結(jié)果一致[13].但葡萄糖和尿素濃度比例繼續(xù)增加，生物量和油脂產(chǎn)率均有下降，且差異性顯著.所以，添加一定的葡萄糖有利于小球藻生物量和油脂的積累，但過高或過低的碳氮源濃度都不利于小球藻的生長(zhǎng)和油脂積累.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探討了碳源和氮源對(duì)一株蛋白核小球藻生物量和油脂產(chǎn)率的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該小球藻不僅對(duì)不同的碳源、氮源吸收和利用程度不同，而且碳氮源濃度的不同也影響其生物量和油脂產(chǎn)率.其最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是尿素，當(dāng)葡萄糖和尿素的濃度分別為30mg/L和1.5mg/L時(shí)，其生物量和油脂產(chǎn)率均達(dá)到最高的8783.9mg/L和126.3mg/L/d，分別比未添加外援性碳源、氮源的BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)條件提高37.9%和125%.所以，選擇和添加一定種類和濃度的外源性碳源和氮源，有利于小球藻生物量的提高和油脂的積累.

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EffectofDifferentCarbonandNitrogenSourcesonLipidAccumulationofChlorellaPyrenoidosawithLipidProduction

JIN Hong1， P.K.Andy Hong2， Diana Bao2， LV Haitang1， LI Wen-ling1， MA Ming-ying1

(1.Chemical Engineering College, Qinghai University，Xining 810016，China； 2.Department of Civil and Environmental Engineexing, University of Utah, Salt Lake 84112, USA)

This paper, taking Chlorella pyrenoidosa as research object,discussed the effects of different carbon and nitrogen sources on the biomass and oil production rate ofChlorellapyrenoidosaand determined the add content of optimal carbon sources and nitrogen sources. The results showed that, the optimal carbon source and nitrogen source ofChlorellapyrenoidosawere glucose and urea. The biomass and oil productivity ofChlorellapyrenoidosaattained maximums of 8783.9mg/L and 126.3mg/L/d respectively,when glucose and urea concentration were 30g/L and 1.5g/L respectively. The biomass and oil productivity ofChlorellapyrenoidosawere increased 37.9% and 125% respectively than those before optimization. This study may provide a theoretical basis for culturing chlorella and improving the biomass and oil productivity ofChlorellapyrenoidosa.

Chlorellapyrenoidosa; carbon sources； nitrogen sources; biomass; oil productivity

2014-03-26

青海省科技廳國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2011-GH-1215).

金虹(1966-)女，遼寧人，教授，從事微生物學(xué)及生物化學(xué)方面的教學(xué)與研究工作.

金虹，P.K.Andy Hong,Diana Bao，等.不同碳氮源對(duì)一株產(chǎn)油小球藻油脂積累的影響[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，37(4)：363-365.

Q93-3

A

1001-2443(2014)04-0363-03