131I-chTNT誘導淋巴瘤Raji細胞凋亡的實驗研究

孫步彤，畢林濤，干慧珠，盧振霞，馬慶杰，高 識，代恩 勇，趙亞男， 魏淑芳

(吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033)

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins Lymphoma,NHL)是一組起源于淋巴結、骨髓、脾臟等淋巴組織的惡性腫瘤，其發病率和死亡率居惡性腫瘤第5位。近年來，NHL在世界范圍內的發病率有持續增長趨勢，可能與人口老齡化、HIV感染和環境污染等有關。盡管目前標準化療對NHL的有效率較高，但復發率也高，且再治療緩解率低，緩解時間短、毒副反應大。探索和發現治療惡性淋巴瘤的新的策略，已成亟待解決的問題。放射免疫治療(RIT)是一種嶄新的分子靶向治療，目前對RIT的研究多集中在血液系統及消化系統惡性腫瘤，特別在淋巴瘤治療取得較好療效。碘[131I]腫瘤細胞核人鼠嵌合單克隆抗體注射液(簡稱131I-chTNT注射液)是放射性核素碘131標記的生物導向制劑，靶向腫瘤壞死區中變性壞死的細胞核，屬嵌合抗體(chimeric antibody)[1]。目前國內外尚未見131I-chTNT關于治療NHL的文獻報道。本研究以淋巴瘤Raji細胞為對象，應用131I-chTNT、131I和生理鹽水處理淋巴瘤Raji細胞，FCM技術檢測細胞凋亡的變化。研究131I標記的腫瘤細胞核嵌合單克隆抗體對惡性淋巴瘤的生物學效應，并對其機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1材料RPMI 1640培養基、胎牛血清購自Gibco公司，131I-chTNT由中國上海美恩生物技術有限公司提供。人淋巴瘤細胞株Raji為本實驗室保存并培養。

1.2方法將保存的人淋巴瘤細胞Raji細胞接種于含10%血清的RPMI 1640完全培養液中，在37℃含5%CO2的濕潤孵箱中培養，2-3 d傳代1次。選對數生長期細胞，按每孔2×106/ml接種于96孔培養板中，將Raji細胞分為3組，即空白對照組(加入100 μl生理鹽水)、單純核素131I(加入100 μl)組及131I-chTNT組(加入100 μl131I-chTNT 100 ng/ml)，每組均設3個復孔。24小時后，1 000 rpm離心5 min，收集各組細胞，以PBS洗滌。離心去PBS，加入預冷的70%的冰乙醇固定，4℃ 24 h。離心棄去固定液，3 ml PBS重懸5 min。500 rpm離心5 min，棄去PBS。加入1 ml PI染液，4℃避光30 min。流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發熒光，激發光波波長為488 nm，發射光波波長大于630 nm，可分析前散射光對側散射光的散點圖及PI熒光的直方圖。將被檢細胞混勻后，上FCM進行單參數分析。用累積曲線分割法計算各期細胞所占比例。

1.3統計學分析采用SPSS 11.0統計軟件包處理，兩兩比較采用配對t檢驗。

2 結果

不同實驗組細胞經處理后，收集細胞進行FCM檢測，結果顯示：131I-chTNT治療組出現了明顯的細胞凋亡，流式細胞儀檢測出典型凋亡峰(即在G1期前出現的亞二倍峰)，見圖1-圖3。Raji細胞對照組凋亡率1.0%，單純核素治療組為1.62%,131I-chTNT治療組為13.61%，131I-chTNT治療組與單純核素治療組和空白對照組比較均有明顯差異，單純核素治療組略高于空白對照組，見表1。

表1 不同實驗組Raji細胞的凋亡誘導作用

圖1空白對照組圖2核素治療組圖3131I-chTNT治療組

3 討論

放射免疫治療(RIT)是眾多腫瘤免疫靶向治療的一種，即利用特異性抗體作載體，與能釋放射線的放射性核素偶合，借助與抗體結合的放射性核素發射射線殺傷腫瘤靶細胞[2]。放射免疫治療的藥物注入體內后與腫瘤細胞特異性的結合，對正常組織影響較小。

碘[131I]腫瘤細胞核人鼠嵌合單克隆抗體注射液(131I-chTNT注射液)是放射性核素碘131標記的生物導向治療制劑，該單克隆抗體靶向于腫瘤壞死區中變性壞死的細胞核，具有廣譜的抗腫瘤活性。131I-chTNT與以往的放射免疫治療不同，它利用惡性腫瘤的具有大量壞死組織特點，特異結合腫瘤壞死區的細胞核，從而對多種腫瘤均有效。是已應用于放化療不能控制的、復發的晚期肺癌的新藥[3-4]。Yu L等[5]報道了應用131I-chTNT治療43例進展期肺癌患者，靜脈注射以及腫瘤內局部注射都取得了較好療效。此外，Ma報道了131I-chTNT在甲狀腺癌肺轉移患者體內的生物學分布，提示該藥物有望應用于甲狀腺癌肺轉移的患者[6]。但目前國內外均未見131I-chTNT關于治療淋巴瘤的文獻報道。

本研究以淋巴瘤Raji細胞為研究對象，應用131I-chTNT、131I以及生理鹽水處理淋巴瘤Raji細胞，然后FCM技術檢測各組細胞凋亡的變化。從而研究131I標記的腫瘤細胞核嵌合單克隆抗體對惡性淋巴瘤的生物學效應。實驗結果顯示131I-chTNT治療組Raji細胞出現了明顯的細胞凋亡。證明131I-chTNT能夠誘導淋巴瘤細胞凋亡，提示該藥物具有抑制淋巴瘤細胞增殖的作用。

總之，腫瘤放射免疫治療是新的治療方法，為難治復發性NHL治療提供有開創性的新途徑。131I-chTNT已顯示了較強的誘導淋巴瘤細胞凋亡、抑制淋巴瘤細胞增殖的作用。通過131I-chTNT對淋巴瘤Raji細胞生物學效應的實驗研究，能為臨床應用提供實驗依據。但131I-chTNT應用于淋巴瘤的安全性及遠期毒性問題仍需進一步臨床試驗及追蹤觀察。

參考文獻：

[1]Wang H,Cao C,Li B,et al.Immunogenicity of Iodine 131 chimeric tumor necrosis therapy monoclonal antibody in advanced lung cancer patients[J].Cancer Immunol Immunother,2008,57(5):677.

[2]Navarro-Teulon I,Lozza C,Pèlegrin A,et al.General overview of radioimmunotherapy of solid tumors[J].Immunotherapy,2013,5(5):467.

[3]Chen S,Yu L,Jiang C,Zhao Y,et al.Pivotal study of iodine-131-labeled chimeric tumor necrosis treatment radioimmunotherapy in patients with advanced lung cancer[J].J Clin Oncol,2005,23(7):1538.

[4]Hdeib A,Sloan A.Targeted radioimmunotherapy:the role of131I-chTNT-1/B mAb (Cotara) for treatment of high-grade gliomas[J].Future Oncol,2012,8(6):659.

[5]Yu L,Ju DW,Chen W,et al.131I-chTNT radioimmunotherapy of 43 patients with advanced lung cancer[J].Cancer Biother Radiopharm,2006,21(1):5.

[6]Ma Q,Gao S,Zhao J,et al.Biological distribution of131I-labeled anti-nucleus antigen monoclonal differentiated thyroid carcinoma[J].Nuclear Science and Techniques,2008,19(4):230.