低氧誘導因子1-α的表達及DNA結合活性在非小細胞肺癌中的臨床意義

潘坤 張澤明 趙學琴 馮欣

·論著·

低氧誘導因子1-α的表達及DNA結合活性在非小細胞肺癌中的臨床意義

潘坤 張澤明 趙學琴 馮欣

目的探討非小細胞肺癌患者肺組織中HIF-1α的表達及DNA結合活性的動態變化與腫瘤病理學特性的關系。方法收集89例非小細胞肺癌患者腫瘤及癌旁正常肺組織標本，RT-PCR檢測HIF-1α的mRNA表達水平，Western blot檢測HIF-1α的蛋白質表達水平，EMSA法檢測HIF-1α DNA結合活性的表達變化，并結合臨床及病理特征進行分析。結果HIF-1α mRNA及蛋白的表達水平在腫瘤組織中均明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0．05)。HIF-1α的表達與非小細胞肺癌病理分期及有無淋巴結轉移有關。腫瘤組HIF-1α 的DNA結合活性較癌旁正常組織增高，2組間差異有統計學意義(P<0．05)。結論HIF-1α的高表達及轉錄活性的增強與非小細胞肺癌發病密切相關，可將此作為抑制腫瘤發病的靶點。

非小細胞肺癌;低氧誘導因子-1α；DNA結合活性

肺癌是惡性腫瘤中發病率和死亡率增長最快的，其中67%左右為非小細胞肺癌(non-smαll-cell lung cαncer， NSCLC)，其惡性度高，轉移早，嚴重危害人類健康。經研究證實，惡性腫瘤發生的一個典型特點是細胞的過度增殖及血管生成，而細胞增殖會消耗大量氧氣，所以實體腫瘤微環境的基本特征之一是低氧。目前已證實低氧誘導因子1-α (hypoxiα inducible fαctor 1 αlph， HIF-1α) 大量表達于人體多種腫瘤中，參與了腫瘤的生長繁殖、遠處轉移、血管生成、細胞凋亡等[1,2]，因此，HIF-1α 的表達可能是腫瘤進展過程中的早期信號，其表達變化可能在一定程度上能反應疾病的進展及分期。HIF-1α可以調節多種靶基因參與腫瘤的生成，其與靶基因結合活性的變化可能也參與了疾病的發生發展過程。本實驗通過檢測89例非小細胞肺癌患者及癌旁正常對照肺組織中的HIF-1α表達水平及DNA結合活性的變化，分析HIF-1α在非小細胞肺癌患者中與腫瘤淋巴結轉移、臨床分期等生物學特性的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取我院2010年7月至2012年4月經手術切除的并經病理確診的非小細胞肺癌患者為研究對象，收集89例患者肺癌組織、癌旁正常肺組織(距離腫瘤邊緣>5 cm以上)標本進行試驗。所選患者術前均未行化療、放療、介入及中醫中藥等抗腫瘤治療，有完整的病例資料。其中男54例，女35例；年齡37～64歲，平均年齡58歲。其中有淋巴結轉移組51例，無淋巴結轉移組38例；TNM：Ⅰ期26例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例。臨床分期標準：按照第七版美國聯合癌癥分類委員會(AJCC)和國際抗癌聯盟(UICC)制訂的TNM分期標準分類。Western blot檢測所用的腫瘤肺組織及癌旁正常肺組織切除后立即置于-70℃冰凍保存。

1.2 實驗方法 RT-PCR：使用由上海生物工程公司合成的擴增引物，嚴格按照該公司TRIZOL試劑使用說明書進行試驗，提取總RNΑ，逆轉錄之后行PCR，得到RT-PCR產物后應用瓊脂糖凝膠電泳，對擴增產物條帶行吸光度半定量分析。反應循環參數：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，32循環后72℃延伸10 min。檢測基因HIF-1α和內參照物β-αctin的引物序列分別為：HIF-1α (433 bp)上游：5’-GCCCCTΑCTΑTGTCGCTTTC-3’，下游：5’-GGCCCΑΑΑCTΑΑΑCTΑTCTGΑ-3’；β-αctin(635bp)上游：5’-CCTΑΑGGCCΑΑCCGTGΑΑ-3’，下游：5’-CTΑGGΑGCCΑGGGCΑGTΑΑTC-3’。

Western blot：0.1 g肺組織剪碎加入RIPΑ 裂解液，冰浴勻漿，4℃ 10 000 g離心，將沉淀去除后得到肺組織總蛋白，將蛋白樣本稀釋成相等濃度分裝，置于- 80℃冰凍保存。實驗時使用微量進樣器將等量蛋白質樣本加至7.5%SDS-丙烯酰胺凝膠孔中，采用200 V電壓電泳，轉印至硝酸纖維膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)過夜孵育，TBST緩沖液漂洗后加入二抗(1∶2 000)室溫雜交1 h，充分漂洗后化學發光試劑盒膠片曝光，對擴增產物條帶吸光度行半定量分析。

電泳遷移率實驗(EMSA)：應用Lighshift化學發光EMSA試劑盒、核蛋白和胞質蛋白抽提試劑盒進行操作(均購自Pierce公司)，參照說明書進行試驗，雙鏈寡核苷酸片段如下( 5’-AGCTTGCCCTACGTGCTGTCTCAG-3’)[3]，應用生物素進行標記，能夠與HIF-1α特異性結合。試驗中設空白對照組及特異性競爭組，空白對照組為反應體系中不加細胞核提取物，特異性競爭組為加入100倍濃度的未標記的HIF-1α一致性雙鏈寡核苷酸序列。

1.3 結果評定 應用上海Tαnon Gis-2010圖像分析系統對Western blot、RT-PCR產物條帶行半定量分析，計算目的條帶與內參照β-αctin的吸光度比值，同時對EMSA活性結果行光密度分析，計算半定量值。

2 結果

2.1 HIF-1α mRNA及蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達及二者與肺癌病理特征的關系 RT-PCR及Western blot結果顯示，HIF-1α的mRNA和蛋白含量在NSCLC組織中的表達明顯高于癌旁正常肺組織，差異有統計學意義(P<0.05)，同時HIF-1α的表達在腫瘤不同分期間差異亦有顯著性，隨疾病臨床分期進展表達呈遞增趨勢。在有淋巴結轉移組HIF-1α的mRNA和蛋白含量表達均明顯高于無淋巴結轉移組，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 對照組及不同病理分期各組間HIF-1α mRNA和蛋白比較

表1 對照組及不同病理分期各組間HIF-1α mRNA和蛋白比較

組別HIF-1αmRNAHIF-1α蛋白癌旁正常對照組(n=89)6.5±1.29.2±1.8NSCLCⅠ期(n=26)11.2±1.9*15.1±2.7*NSCLCⅡ期(n=3415.8±2.8*#18.8±3.5*#NSCLCⅢ期(n=29)21.2±3.5*#☆25.5±4.9*#☆ F值395.386249.693 P值0.0000.000

注：與正常組比較，*P<0.05；與Ⅰ期比較，#P<0.05；與Ⅱ期比較，☆P<0.05

表2 對照組及有無淋巴結轉移組間HIF-1α mRNA和蛋白比較

表2 對照組及有無淋巴結轉移組間HIF-1α mRNA和蛋白比較

組別HIF-1αmRNAHIF-1α蛋白癌旁正常對照組(n=89)6.5±1.29.2±1.8無淋巴結轉移組(n=38)13.6±2.1*16.4±3.1*有淋巴結轉移組(n=51)18.7±3.9*#20.9±4.2*#F值419.544270.003P值0.0000.000

注：與正常組比較，*P<0.05；與無轉移組比較，#P<0.05

2.2 HIF-1α的DNA結合活性在非小細胞肺癌組織中的表達 EMSA試驗中，空白對照組、特異性競爭組、癌旁組織及腫瘤組織組各樣本圖像結果顯示(圖1)，空白對照組僅有自由帶，無結合帶，特異性競爭組中亦無結合帶，提示探針與HIF-1α的結合是特異性的。在癌旁組織及腫瘤組織中，圖像顯示出了深淺不一的DNA-蛋白質結合帶。癌旁組織HIF-1α的DNA結合活性水平較低，腫瘤組織HIF-1α的DNA結合活性迅速升高，與對照組比較差異有顯著性意義，但q檢驗提示，HIF-1α的DNA結合活性與病理分期、有無淋巴結轉移無關。

3 討論

在全球范圍內肺部腫瘤是嚴重危害人類健康的主要惡性腫瘤，按病理類型分類以非小細胞肺癌為主，由于非小細胞肺癌患者在早期并無典型癥狀，約為三分之二的患者確診時已處于疾病晚期，同時失去了最佳治療時機。目前在我國非小細胞肺癌的治療仍以傳統的手術治療、全身或局部化療、放療為主，但非小細胞肺癌Ⅰ期患者即使是經手術完全切除的，術后2年的復發或轉移率也超過40%。因此，探討新的非小細胞肺癌治療方法已成為當前腫瘤治療領域的熱點及難點。

圖1 EMSA檢測HIF-1α的DNA結合活性

低氧誘導因子-l (hypoxiα inducible fαctor 1， HIF-1)是異源二聚體轉錄因子，由α和β兩個亞基組成，α亞基是功能亞基，被稱為氧感受器。HIF-1α能調節參與糖酵解、紅細胞增生、細胞增殖、血管生成等共100多種低氧適應性基因的轉錄水平[4]，因此，其結合活性及蛋白含量的變化均可引起相應目標基因的表達變化進而導致相應疾病，它可誘導靶基因轉錄激活，在調節腫瘤血管生成、侵襲轉移及耐藥等方面發揮重要作用[5]。大部分學者經研究發現，HIF-1α的表達與非小細胞肺癌臨床分期、淋巴轉移有關，而與病理類型、分化程度等無關[6-8]，另有學者則持相反意見，認為HIF-1α的表達與淋巴轉移無關[9]。目前國內針對此因子的研究多應用免疫組化及原位雜交等試驗方法，定量研究較少。本實驗通過RT-PC、Western blot來研究非小細胞肺癌患者中HIF-1α的表達水平，同時應用EMSA研究HIF-1α DNA結合活性的變化，探討其與腫瘤臨床生物學特性的關系

本試驗通過各腫瘤組與對照組的數據對比，發現在對照組癌旁正常肺組織中，HIF-1α蛋白及DNA結合活性均有一定表達，提示在正常肺組織中HIF-1α對其下游目標基因的調節作用也是存在的。非小細胞肺癌患者Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期腫瘤組織的HIF-1α的mRNA和蛋白含量均呈遞增趨勢，各組與對照組比較差異均有顯著性意義，同時腫瘤組各組間HIF-1α的mRNA和蛋白含量比較差異亦有顯著性，提示HIF-1α量的表達變化在一定程度上可反應疾病的進展程度。在有淋巴結轉移組，HIF-1α亦表現出了高表達趨勢，與無淋巴結轉移組比較差異有顯著性意義，提示HIF-1α在一定程度上可反應疾病的預后。Hung等[10]研究發現，HIF-1α可通過上調靶基因TWIST1和Snail表達水平在非小細胞肺癌的增殖、侵潤、轉移中發揮作用，TWIST1和Snail的高表達導致了肺癌患者更短的生存期及更快的復發。Karetsi等[11]發現HIF-1α可上調目標基因VEGF的表達在腫瘤血管生長中發揮作用。同時亦有學者發現，在人肺腺癌細胞株中HIF-1α可通過上調抗凋亡基因Survivin的表達，進而參與調控細胞周期和細胞凋亡[12]，在惡性腫瘤的發展中發揮作用。另有研究表明， HIF-1α可促使腫瘤組織血管發生，增加腫瘤遠處侵襲、加速轉移，降低腫瘤對放、化療的敏感性[13]。上述結果均提示，HIF-1α可能在非小細胞癌的發生、轉移中發揮作用，其表達水平的變化在一定程度上可反應疾病的進展程度及預后。

HIF-1α通過與目標基因特定序列DNA結合進而調控它們的轉錄及表達[14]，因此，HIF-1α與目標基因DNA結合能力的大小在一定程度上可決定其對靶基因的調控能力。本實驗發現，腫瘤組HIF-1α的DNA結合活性較對照組明顯增強，提示在腫瘤組織中不僅增加的蛋白含量在腫瘤生長中發揮了一定作用，增強的DNA結合活性亦增強了對靶基因的轉錄作用。HIF-1α的DNA結合活性在腫瘤各組間未發現有表達差異，在有淋巴結轉移及無淋巴結轉移組間亦未發現顯著性意義，提示HIF-1α可能在腫瘤組織中通過增強對靶基因的調控進而促進惡性腫瘤新生血管形成、加速腫瘤浸潤，但其與靶基因的DNA結合能力不能反應疾病的進展程度及預后。在臨床應用中，可考慮通過分子水平抑制HIF-1α與靶基因DNA序列結合，進而在抑制腫瘤發生發展中發揮作用。

綜上所述，HIF-1α在肺部腫瘤細胞的表達增加表現在多個方面，包括基因轉錄水平和蛋白表達水平，同時其與靶基因的結合活性亦呈增高趨勢，上述各因素共同作用增加了對腫瘤細胞的供血、供氧及能量，使癌細胞得以迅速增殖和浸潤。因此，研究如何降低HIF-1α的表達及DNA結合能力對于非小細胞癌的治療及改善預后具有重要的臨床意義。

1 Semenza GL.Targeting HIF-1 for cancer therapy.Nature Reviews.Cancer,2003,3: 721-732.

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4 劉衡．HIF-1與肺癌關系研究新進展．醫學綜述，2012，18：3957-3959．

5 劉登輝，劉紅光．HIF-1α和VEGF在乳腺癌中作用的研究進展．腫瘤藥學，2013，3：7-12．

6 Chen Y,Yang H,Hu J,et al.Expression of hypoxia inducible factor-1alpha and relationship thereof to apoptosis related protein in non-small cell lung cancer.Zhonghua yi xue za zhi,2007,87:921-923.

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10 Hung JJ,Yang MH.Prognostic significance of hypoxia-inducible factor-1alpha,TWIST1 and Snail expression in resectable non-small cell lung cancer.Thorax,2009,64:1082-1089.

11 Karetsi E,Maria G,Ioannou,et al.Differential expression of hypoxia-inducible factor 1α in non-small cell lung cancer and small cell lung cancer.Clinics,2012,67: 1373-1378.

12 李偉，陳余清，孫艷，等．人肺腺癌細胞株A549中HIF-1α對Survivin的表達調控．中國癌癥雜志，2011，21：427-434．

13 Yoon SY,Reum H,Lee,et al.Thymosin β4 expression correlates with lymph node metastasis through hypoxia inducible factor-α induction in breast cancer.Oncology Reports,2011,25:23-31.

14 Jeong JK,Moon M.Hypoxia inducing factor-1alpha regulates tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand sensitivity in tumor cells exposed to hypoxia.Biochemical and Biophysical Research Communications,2010,399: 379-383.

The clinical significance of expression and DNA binding activity of hypoxia-inducible factor 1-α in non-small cell lung cancer

PANKun,ZHANGZeming,ZHAOXueqin,etal.DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Hebei,Baoding071000,China

ObjectiveTo observe the dynamic changes of expression and DNA binding activity of hypoxia-inducible factor 1-α in non-small cell lung cancer (NSCLC),and to investigate the correlation between the changes and tumor pathological characteristics.MethodsEighty-nine cases of NSCLC tissues and adjacent normal lung tissue specimens were collected,RT-PCR was used to detect the expression levels of HIF-1α mRNA,and Western Blot was used to determine the expression levels of HIF-1α protein.EMSA assay was used to examine DNA binding activity of HIF-1α.The correlation between the expression levels and the clinical pathological features of tumors was analyzed.ResultsThe expression levels of HIF-1α mRNA and protein in tumor tissues were significantly higher than those in adjacent tissues (P<0.05).Their expression levels were correlated with tumor staging and lymph node metastasis (P<0.05).HIF-1α DNA binding activity was significantly increased,as compared with that in adjacent normal tissue (P<0.05).ConclusionThe overexpression of HIF-1αand enhancement of transcription activity are closely correlated to pathogenesis of NSCLC,which can be regarded as a target in inhibiting pathogenesis of NSCLC．

non-small cell lung cancer;hypoxia-inducible factor 1-α;DNA binding activity

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.003

071000 河北省保定市，河北大學附屬醫院呼吸內科

R 734.2

A

1002-7386(2014)07-0972-04

2013-10-20)