結直腸癌組織與血液KRAS/BRAF基因突變表達一致性檢測分析

馬文華 李娜 趙利平 張明明 安永輝

·論著·

結直腸癌組織與血液KRAS/BRAF基因突變表達一致性檢測分析

馬文華 李娜 趙利平 張明明 安永輝

目的我國大部分結直腸癌患者發現的時候已經是中晚期，很難取到病理組織行KRAS、BRAF基因檢測，故限制靶向藥物應用，此實驗研究目的是對原發腫瘤和血清KRAS/BRAF基因突變一致性進行研究。方法共納入48例患者，分別對血清和腫瘤組織中KRAS及BRAF基因表達情況采用液相芯片技術進行檢測。結果原發腫瘤組織KRAS突變率40%(19/48)，血清42%(20/48)。在19例腫瘤組織樣本KRAS突變，14例血清樣本中的相同的突變，符合率73.7%(14/19)。在1個腫瘤組織檢測到BRAF基因突變，在血清樣本中未發現BRAF基因突變。結論在KRAS基因的原發腫瘤和配對血清樣本之間突變率有很好的一致性。

結直腸癌；KRAS基因；BRAF基因；突變；液相芯片技術

結直腸癌作為最常見的惡性腫瘤之一，位居癌癥死因第3 位，每年有超過一百萬的大腸癌新增病例[1]。目前抗EGFR治療基因靶標臨床研究主要集中于KRAS、BRAF基因。BRAF基因的突變是野生型KRAS患者療效不佳主要因素[2]。在結直腸癌應用靶向藥物之前行KRAS基因突變檢測已經被NCCN指南推薦。而行BRAF基因突變檢測也是必要的。但中晚期結直腸癌患者組織標本獲取率低，許多晚期結直腸癌患者很難在治療前及治療中取得組織標本以明確KRAS、BRAF基因突變狀況。另外由于腫瘤組織的異質性、原發灶和轉移灶基因型表達存在差異[3]。本研究對腫瘤組織及血清KRAS、BRAF突變情況分別進行檢測，探討在結直腸腫瘤組織與血液中KRAS /BRAF之間的一致性程度，確定血液中KRAS/BRAF基因突變情況是否可以替代結直腸癌組織學基因檢測。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者2010年8月至2013年8月，共有45例。這些患者均經病理組織學證實。并通過影像學及手術結果，根據美國癌癥聯合委員會(AJCC)結直腸癌的TNM分期系統進行分期。

1.2 標本制備與檢測方法 組織標本為手術切除腫瘤組織或石蠟包埋切片；采集外周血5 ml，基因突變檢測由廣州益善公司負責檢測，采用液相芯片技術進行突變檢測，此技術具有特異性強，靈敏度高，重復性好的特點，突變富集-液相芯片技術特別適用于血漿、胸腹水等體液標本的檢測。

1.3 統計學分析 應用SPSS 15.0軟件，應用Kapparel統計方法，κ系數(k≥0.7較高的一致性， 0.7>κ≥0.4一致性一般， κ<0.4一致性較差)被用來比較組織與血清K-RAS，B-RAF基因突變的一致性。

2 結果

2.1 患者的特點 在48例患者中，男32例，女16例；年齡27～83歲，平均年齡56歲。原發腫瘤位于結腸有26例(54.2%)，位于直腸22例(45.8%)。腫瘤分期情況如下：患者為Ⅰ期4例，Ⅱ期18例，Ⅲ期20例和Ⅳ期6例。

2.2 KRAS基因腫瘤組織與血清突變情況 在48個樣本中，原發腫瘤組織KRAS突變率40%(19/48)，血清42%(20/48)。在19例腫瘤組織樣本KRAS突變，14例血清樣本中的相同的突變，符合率73.7%(14/19)。突變位點位于相同密碼子。9例KRAS突變情況的不一致(27.8%)，其中5例在腫瘤組織中KRAS突變但血清中為野生型, 4例血清中KRAS基因突變但組織中為野生型。腫瘤組織和血液樣本KRAS突變率之間的一致性較高(κ= 0.60),分別行ⅠⅡ期、Ⅲ期、Ⅳ期KRAS基因組織與血清突變符合率比較，突變符合率與分期無關。見表1、2。

表1 KRAS/BRAF基因在組織與血清表達情況

表2 血清和原發腫瘤KRAS突變統計分析(kappa=0.60)

2.3 BRAF腫瘤組織和血清突變情況 在1個腫瘤組織檢測到BRAF基因突變，占2%(1/48)，在血清樣本中未發現BRAF基因突變，考慮到基因表達率低，此次研究樣本量少，故未行統計分析。

3 討論

KRAS基因突變是結直腸癌發展過程中早期常見事件。大約35%～45%的人類腫瘤細胞中出現KRAS基因突變[4]，并且KRAS基因活化在腫瘤發生中可能作為啟動事件。既往研究報道可在血液中檢測到腫瘤細胞[5,6]，鄒江等[7]用PCR-RFLP法檢測結直腸癌患者血漿和癌組織的KRAS基因突變，結果表明組織與血漿間有很好的一致性。

BRAF和KRAS同屬MAP激酶(MAPK)通路成員，分為ARAF、BRAF、CRAF三個亞型，而BRAF在3個亞型中突變頻率最高, 大約7%～8%的人類腫瘤發生BRAF突變[8], 主要發生于結腸癌、黑色素瘤和甲狀腺癌中。該突變導致下游MEK-ERK 信號通路持續激活, 對腫瘤的生長增殖和侵襲轉移至關重要, 是抗黑色素瘤等V600E 突變腫瘤的有效作用靶標之一。2011年,首個BRAFV600E 靶向抑制劑威羅菲尼被FDA 批準上市, 用于治療BRAFV600E 突變的晚期黑色素瘤患者[9]， BRAF和KRAS突變是相互排斥的。在這項研究中，只有1例患者檢測到BRAF基因突變發生在野生型KRAS患者中。

既往研究表明，血清游離DNA可能來源于細胞凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放在血清中。另一個可能的機制是，游離循環DNA是由活細胞主動釋放[10]。因此他是利用血清檢測來預測組織基因突變的理論基礎，因臨床工作中部分病人病理組織不能獲取，而血清取得方便性，如通過試驗研究兩者之間有高度一致性，則KRAS/BRAF基因突變的檢測可能是由血清標本中的基因突變的檢測取代。

在本研究中，我們首先評估了血清樣品中KRAS和BRAF基因突變之間的一致性程度，KRAS基因突變在組織與血清中(K=0.60)存在一致性，故由此可推薦對于不能獲取組織的患者可通過血清檢測來替代。因BRAF突變率低，血清中未發現突變，未行統計分析。

本研究中基因突變率組織與血清并不完全一致，可能與循環DNA或轉移組織與原發腫瘤存在異質性有關[10]。另一種可能性是腫瘤組織基因檢測因取材局限性，所以并不能反映腫瘤的整體基因情況；此外，釋放的DNA的血漿被稀釋，檢測技術的敏感性等都有可能妨礙了血漿DNA突變情況檢測準確性。

通過此研究，我們已經證明循環KRAS突變的血清和原發性大腸癌的腫瘤一致。我們認為血漿KRAS基因突變情況可以反映結直腸癌腫瘤組織的KRAS基因突變情況，為檢測腫瘤靶點提供新的檢測方法。也為無法取得病理組織患者帶來新的治療希望，此研究不足之處在于樣本量偏少，希望能擴大研究樣本量，進一步的臨床試驗，并能基于血清基因突變情況開展靶向治療研究。

1 Ferlay J,Shin HR,Bray F,et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008.Int J Cancer,2010,127: 2893-2917．

2 Loupakis F, Ruzzo A, Cremolini C, et al.KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer.Br J Cancer，2009，101:715-721.

3 Di Fiore F, Charbonnier F, Lefebure B,et al.Clinical interest of KRAS mutation detection in blood for anti-EGFR therapies in metastatic colorectal cancer.Br J Cancer，2008，99:551-552.

4 Plesec TP,Hunt JL.KRAS mutation testing in colorectal cancer.Adv Anat Pathol,2009,16:196-203.

5 Stroun M,Anker P,Maurice P,et al.Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients.Oncology,1989,46:318-322．

6 Goebel G,Zitt M,Zitt M,et al.Circulating nucleic acids in plasma or serum (CNAPS) as prognostic and predictive markers in patients with solid neoplasias.Dis markers，2005,21:105-120.

7 鄒江，錢家鳴，李曉,等.血漿K-ras基因突變檢測在結腸癌診斷中的意義.中華腫瘤內科雜志，2002，22:371-373.

8 Cutler RE, Jr Stephens RM, Saracino MR, et al.Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase.Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:9214-9219.

9 Vultur A, Villanueva J, Herlyn M.Targeting BRAF in advanced melanoma: a first step toward manageable disease.Clin Cancer Res, 2011, 17: 1658-1663.

10 Pathak AK, Bhutani M, Kumar S, et al.Circulating cell-free DNA in plasma/serum of lung cancer patients as a potential screening and prognostic tool.Clin Chem，2006，52:1833-1842.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.037

050031 石家莊市，河北醫科大學第一醫院腫瘤科

安永輝，050031 河北醫科大學第一醫院腫瘤科；

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R 735.3

A

1002-7386(2014)07-1048-03

2013-11-14)