Resolvin D1對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的保護作用

段麗娜 路紅濤

急性肺損傷 (acute lung injury, ALI) 是各種原因導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致的急性低氧性呼吸功能不全[1]。其病理生理機制包括氧化反應與抗氧化反應的失調和炎癥反應與抗炎反應的失調[2]。盡管目前有多項治療方法，但是尚無有效的干預措施，病死率極高[3-4]。因此急需尋找有效的藥物治療急性肺損傷。

Resolvins為內源性抗炎物質Omega-3多不飽和脂肪酸(EPA和DHA)的代謝產物。EPA和DHA可分別產生E-系列(Resolvin E)和D-系列(Resolvin D)的Resolvins。 多個研究顯示Resolvin D1(RvD1)具有可緩解小鼠模型變應性氣道炎癥等多種抗炎作用[5-7]，然而尚未見到RvD1對急性肺損傷保護作用的相關研究。因此我們假設RvD1對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的小鼠急性肺損傷具有保護作用，并進一步探討可能的機制。

材料和方法

一、主要試劑

雄性BALB/c小鼠21只，體質量20～25 g由西安交通大學醫學院實驗中心提供。 RvD1購于Cayman公司。丙二醛(malondialdehyde, MDA)測試盒購于南京建成生物工程研究所。LPS購于Sigma公司。IL-10、IL-6 ELISA檢測試劑盒是由武漢博士德生物工程有限公司提供。

二、實驗方法

1. 實驗模型和分組： BALB/c小鼠隨機分3組(7只/組)。利用10%水合氯醛麻醉小鼠(0.3～0.4 ml/kg)。①對照組，氣道內滴注PBS 60 μl；②LPS模型組：氣管插管，氣道內滴注LPS(100 μg/60 μl); ③RvD1組：在氣道內滴注LPS 30 min前，尾靜脈注射RvD1(600 ng(100 μl)/小鼠)。LPS氣道滴注6 h后處死小鼠。小鼠均在西安交通大學醫學院動物中心SPF級動物房飼養。

2. 收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF): 造模6 h后將小鼠麻醉，股動脈放血處死，利用0.6 ml預冷的PBS進行支氣管肺泡灌洗(2次/只)，肺泡灌洗液的回收率達80%。BALF在4 ℃，800×g，離心10 min。分別收集沉淀和上清，BALF上清液在-80 ℃保存備用。離心后的細胞沉淀用PBS重新重懸，利用細胞計數板進行細胞計數。取細胞沉淀涂片，涼干后行瑞氏染色，進行中性粒細胞計數。

3. 肺組織病理學檢查: 取出左肺組織放入10%甲醛固定，固定后進行脫水，透明，石蠟包埋后切片(4 μm)，進行蘇木素-伊紅( HE )染色，光鏡觀察肺組織病理學改變。

4. 肺組織內MDA含量測定： 肺組織內MDA濃度測定采用南京建成生物工程公司試劑盒，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

5. BALF中IL-10、IL-6濃度檢測： BALF上清中IL-10、IL-6的濃度利用ELISA方法檢測，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

三、統計學方法

所有數據以M±SD形式表示。采用SPSS13.0軟件進行正態性檢測，方差齊性檢驗。組間比較采用單因素方差分析，非正態分布數據經正態轉換后再進行統計學處理，P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、RvD1對肺組織病理改變的影響

如圖1所示，與對照組相比，氣道內滴注LPS的小鼠肺組織病理顯示，肺泡及肺間質大量出血，組織水腫，肺泡間隔增厚，正常的肺組織結構明顯被破壞。而應用RvD1預處理(在LPS給藥前30 min)小鼠后上述改變被明顯減輕。

對照組

LPS模型組

Resolvin

二、RvD1對小鼠肺組織浸潤炎癥細胞數的影響

如圖2所示氣道內滴注LPS 6 h后，(圖2A) BALF內炎癥細胞數顯著升高 (P<0.01，與對照組相比)，(圖2B)中性粒細胞計數顯著升高(P<0.01，與對照組相比)。而應用RvD1預處理后，可顯著減輕LPS誘導小鼠急性肺損傷炎癥細胞的浸潤。

注：A: BALF中炎癥細胞總數計數；B: BALF內中性粒細胞數；*P<0.01 vs. 對照組; #P<0.01 vs. LPS模型組

三、RvD1對小鼠肺組織MDA濃度的影響

如圖3所示，MDA為體內脂質氧化損傷的標志。與對照組比較， LPS模型組MDA的濃度明顯升高(P<0.01)。而而應用RvD1預處理后，可顯著抑制LPS誘導的MDA濃度升高。

注：*P<0.01 vs. 對照組; #P<0.01 vs. LPS模型組

四、RvD1對小鼠肺組織分泌細胞因子的影響

如圖4所示，氣道內滴注LPS 6 h后， BALF中IL-6(圖4A)的濃度與對照組相比顯著升高(與對照組相比P<0.01)，保護性細胞因子IL-10 (圖4B) 較對照組有所升高，而應用RvD1在LPS干預前30 min預處理小鼠，BALF中IL-6濃度顯著下降，保護性細胞因子IL-10顯著升高(與LPS模型組相比P<0.01)。提示RvD1可能抑制急性肺損傷小鼠促炎性細胞因子的分泌，促進抗炎性細胞因子的分泌，改善促炎反應與抗炎反應的平衡，從而對急性肺損傷發揮保護作用。

注：A: IL-6在BALF中的濃度；B: IL-10在BALF中的濃度；*P<0.01 vs. 對照組; #P<0.01 vs. LPS模型組

討 論

在LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型中，RvD1預處理可顯著減輕肺組織病理損傷，減少肺組織內浸潤的炎癥細胞，抑制炎性細胞因子IL-6的分泌，促進保護性細胞因子IL-10的分泌，通過減少MDA的產生，進而減輕氧化損傷，從多方面對急性肺損傷起保護作用。

當機體遭遇各種炎性刺激(如感染等)后，可促進炎癥細胞在肺組織內大量浸潤，促進各種氧自由基產生，促進TNF-α，IL-6，IL-1等促炎性細胞因子的大量釋放，促進組織水腫，進而加劇組織損傷[8-9]。本研究中得出了相同的結論，在LPS干預組小鼠肺組織內浸潤炎癥細胞總數及中性粒細胞數顯著增多，脂質氧化損傷指標MDA含量顯著升高，上述改變提示LPS誘導小鼠急性肺損傷模型制作是成功的。

促炎細胞因子在急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征中起關鍵性作用。研究顯示急性肺損傷和敗血癥臨床患者，如IL-6和TNF-α等促炎性細胞因子持續性升高，則表示患者預后極差[10]。因此IL-6作為炎癥的標志，其水平高低可顯示炎癥的輕重，本研究中IL-6明顯升高，也提示急性肺損傷模型制作的成功。

在對急性肺損傷藥物干預研究中顯示，藥物處理可顯著抑制TNF-α，IL-6，IL-1等炎性細胞因子的分泌，減輕組織氧化損傷，進而減輕動物模型肺損傷，對肺組織起到保護作用[8-9, 11]。本研究中顯示了相同的結論，而RvD1預處理后可顯著減少肺組織內浸潤的炎癥細胞，抑制IL-6的大量分泌，減輕脂質氧化損傷，減輕小鼠肺組織病理損傷，對小鼠急性肺損傷發揮保護作用。

急性肺損傷的病理機制為抗炎反應與驗證反應的失衡，而體內失控性釋放的大量炎癥介質與抗炎因子間的平衡決定了急性肺損傷病情的發展。IL-10作為人體內重要的抗炎因子，可抑制炎性反應，重建抗炎反應和炎癥反應的平衡。研究發現，因ARDS死亡患者的疾病初期，如BALF中的IL-10濃度過低，則預后較差，提示IL-10不足可能是體內失控性炎癥反應與抗炎反應失衡導致ARDS的預后較差[12-13]。進一步研究發現動物吸入IL-10可顯著抑制BALF中TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌，從而對急性肺損傷發揮保護作用[14-15]。因此IL-6/IL-10的比例在一定程度上反應了疾病的走向。在本研究中LPS模型組小鼠IL-6較對照組升高5.7倍，IL-10僅僅升高1.8倍，促炎反應與抗炎反應失衡。而應用RvD1預處理后IL-10的分泌較LPS模型組比較升高了16倍，RvD1可能具有重建炎癥反應與抗炎反應的平衡，改善急性肺損傷的作用。

本研究證明了RvD1可促進抗炎性細胞因子IL-10的分泌，抑制促炎性細胞因子IL-6的產生，減少炎癥細胞的浸潤，改善肺組織病理變化，減輕組織氧化損傷，重建炎癥反應與抗炎反應的再平衡，從多個方面抑制急性肺損傷的發生、發展。上述研究結果提示RvD1可能具有治療急性肺損傷的潛在作用。

參 考 文 獻

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