慢性間歇低氧誘導小鼠學習記憶障礙的實驗研究

琚靜美 陳 銳 王 婧 明 紅 萬宗仁 劉春風

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, OSAHS)由于睡眠中反復發生上氣道部分或完全阻塞而表現為夜間間歇低氧和睡眠結構紊亂，其最重要的一個病理生理特點是頻繁發生的夜間低氧和再氧合，這也是引起認知功能障礙的最為關注的原因[1-3]。目前的研究認為，海馬、前額葉皮層是公認的與學習記憶密切相關的腦區。學習記憶的中樞機制是突觸傳遞的長時程增強(long-term potentiation, LTP)[4]，其中，與Ca2+通道藕聯的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)是鈣信號轉導系統中的關鍵分子，參與了神經突觸可塑性和LTP的形成,與學習記憶功能密切相關[5-6]。Caspase 家族的成員在凋亡的信號傳遞中具有重要的調控和效應作用[7]，Caspase-3 基因的異常表達和活化水平在再灌注損傷模型中，是啟動受損區神經元凋亡的關鍵環節[8]。本研究通過建立小鼠慢性間歇低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH) 模型，觀察小鼠隨著低氧時間延長，其空間學習記憶能力的變化，同時觀察CIH對NMDAR亞單位1(NR1)表達的影響以及海馬神經細胞caspase-3表達的情況，以探討CIH對認知功能損傷的分子機制。

材料與方法

一、 實驗動物

健康清潔級ICR雄性幼鼠60只(3～4周齡)，體重15～20 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，所有的小鼠均喂以同樣的干飼料，飲用普通水，室溫控制在20±2 ℃，相對濕度50%～70%，適應性飼養7 d，使其適應新環境。

二、實驗儀器及主要試劑

間歇低氧裝置是本實驗組與天津合普工貿有限公司共同設計，由有機玻璃低氧艙(規格為r=20 cm，h=15 cm)、電腦控氧儀、氧濃度探頭(Wismar公司，德國)壓縮空氣機、氮氣源、氣體傳輸管道等部分組成。Morris圓形水迷宮及視頻分析軟件(上海吉量科技有限公司)；Leica激光共聚焦掃描顯微鏡及分析系統(德國Leica Co. Ltd.)。β-肌動蛋白、NMDAR1一抗、HRP標記的羊抗兔IgG二抗購自Abcam 公司，Caspase-3克隆抗體購自Santa Cruz公司，FITC標記的驢抗羊二抗、DAPI購自碧云天生物科技研究所。

三、實驗方法

1. 實驗動物分組及間歇低氧模型建立：60只ICR小鼠分為常氧對照組(UC)30只和慢性間歇性缺氧組(CIH) 30只，CIH組根據低氧造模時間再分為間歇低氧3 d(A組)、1周(B組)、2周(C組)、4周(E組)、6周(F組)組，及造模結束后常氧飼養1月的10周組(G組)，每組5只，共6組，同期設6組對照組。CIH組小鼠每天8 h飼養于低氧艙內(8∶00AM- 4∶00PM)，向艙內循環通入氮氣和壓縮空氣各30 s，以60 s為一個循環，使每一循環艙內的最低氧濃度達到6%～8%，然后再逐漸恢復到20%～21%。UC組通入同樣流速的壓縮空氣，該實驗周期為6周。CIH組在造模早期，有3只小鼠發生死亡，予以剔除，并分別在兩組各補充5只小鼠。

2. Morris水迷宮行為學檢測：定位航行實驗：造模前小鼠先進行Morris水迷宮行為學測定，第1天開始訓練2次，隨后每天訓練4次，歷時5 d。每次小鼠隨機從四個不同象限面向池壁放入水中，觀察并記錄小鼠尋找并爬上平臺的路線圖、所需時間(逃避潛伏期) 及各象限的游泳距離和時間，取四個象限平均值作為當日成績。如120 s仍未找到平臺，由操作者將小鼠引上站臺休息，并將逃避潛伏期記為120 s。記錄第5天成績，作為間歇低氧造模前成績，并在低氧3 d、1周、2周及6周造模結束再次訓練后分別對這兩組進行檢測?？臻g探索實驗：在實驗終點6周定位航行實驗結束后次日，將平臺撤除，任意一點為入水點，記錄大鼠在120 s內穿過原平臺區域的次數和在原平臺象限內游泳時間占整個時間的百分比。

3. 取材：于1、2、4、6周四個行為學測試實驗結束當日以及造模結束常氧飼養1月(即10周)之日，每組處死5只小鼠。海馬取材方法：脫臼法處死小鼠，迅速剖開顱骨，完整取出腦組織，在視交叉后冠狀面剖開腦組織即可見到海馬，再沿正中矢狀面平分腦組織，分左右海馬組織，過液氮后快速-80 ℃凍存，待指標檢測。

4. Western blot 檢測海馬中NR1蛋白：提取組織蛋白質，用Bradford法測定蛋白質含量，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗兔抗小鼠NMDAR1、羊抗兔IgG二抗孵育，化學發光，顯影，定影，顯微圖像分析。

5. 激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光標記Caspase-3的表達情況：取新鮮海馬組織，4%多聚甲醛固定30 min，做冰凍切片(厚度為20 um)，漂洗，5%脫脂奶粉封閉，加一抗Caspase-3，FITC標記的驢抗羊二抗孵育，加DAPI(0.3 μg/ml)染細胞核，90%酒精脫水，熒光抗淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

四、統計學方法

結 果

一、行為學檢測結果

1. 間歇低氧對小鼠學習能力的影響：從間歇低氧第3天起，CIH組小鼠的逃避潛伏期即高于UC組(P>0.05)；隨著間歇低氧時間的延長，CIH組平均逃避潛伏期均逐漸延長，各組小鼠的逃避潛伏期均明顯高于UC組(P<0.05)，尋找平臺的時間較長。完成造模6周的12只小鼠，重新訓練迷宮3 d，每天4次，發現小鼠訓練后成績提高很慢，明顯慢于造模前及對照組，3 d后測試的平均逃避潛伏期明顯高于UC組(P<0.01)。大部分對照組小鼠在造模期間隨著訓練次數的增多，可以在很短時間內找到平臺，對照組組間比較差異無統計學意義(F=1.107，P>0.05)，實驗組組間比較差異有統計學意義(F=5.004，P<0.01)，見表1，圖1。

2. 間歇低氧對小鼠記憶成績的影響：CIH 組120 s內穿越平臺次數為(4.58±2.58)次，較UC組顯著減少[(8.06±2.74) 次，P<0.01]；在平臺所在象限的游泳時間與UC組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 造模6周后CIH組與對照組小鼠記憶能力比較

注：與UC組比較aP<0.01

二、 Westen Blot檢測各組小鼠海馬神經元NR1蛋白表達的變化

如圖2所示，與對照組比較，CIH組B、C、E、F及G組，NR1蛋白的表達均降低，與其對照組比較均有統計學意義(P<0.01)；其中C、E組降至最低水平(P<0.01)。A組NR1蛋白表達較其對照組稍有升高跡象。復氧1月后的G組NR1蛋白仍較對照組降低(P<0.01)，NR1蛋白表達與其F組相仿。

注：A：CIH組，B：UC組

注：*P<0.01

表1 造模過程中各組平均逃避潛伏期比較

注：與UC組比較aP<0.05；bP<0.01；CIH組隨造模時間延長，組間比較F=5.004，P<0.01；UC組組間比較F=1.107,P>0.05

三、各組激光共聚焦顯微鏡下熒光標記Caspase-3的表達情況

激光共聚焦鏡下，綠色熒光代表胞漿內Caspase-3的表達，蘭色熒光是熒光標記的細胞核。與對照組比較，CIH組A、B、C、E、F及G組Caspase-3的表達均升高，除A組外，其余各組與其對照組比較差異均有統計學意義(P<0.01)；其中C、E組升高最顯著(P<0.01)，復氧1月后的G組Caspase-3的表達仍較對照組升高(P<0.01)，略低于F組。由A到E組，隨著低氧時間延長，Caspase-3的表達有逐漸升高趨勢，但兩組組間比較均無統計學差異(P>0.05)，見圖3、圖4。

討 論

認知功能損害是OSAS最為常見的并發癥之一，可以表現在記憶、注意、集中、執行等功能以及總體智力損害等多方面[9-10]，其中短期記憶力和注意損害是OSAHS患者嚴重的認知障礙[11]。但是，OSAS引起認知功能損害的機制至今尚不完全明確，間歇低氧、睡眠結構破壞、交感神經興奮、激活氧化應激和炎癥反應通路，都是認知功能損害的可能機制，但其中確切的分子靶點尚不清楚。

注：與對照組相比，*P<0.01

圖4 UC組和CIH各組Caspase-3表達的激光共聚集顯微鏡細胞圖

本研究中，與對照組相比，CIH組小鼠水迷宮逃避潛伏期顯著延長，而穿越平臺次數顯著降低，表明慢性間歇性低氧對小鼠的學習和記憶功能均有損害，這一結果與國內外學者的報道相一致[12-14]。本研究顯示這種損害發生在低氧早期，有隨著低氧時間延長和程度加重而加重的趨勢，呈時間-效應關系，但其機制尚不明確，可能與海馬對低氧反應的易感性，誘導氧化應激和炎癥反應、激活鈣信號轉導系統及其相關神經遞質，導致海馬結構、功能改變和神經元凋亡有關[15-16]。

本研究通過免疫熒光染色，發現從間歇低氧3 d開始(A組)即有Caspase-3的活化，2周(C組)時達最高峰，并可以維持4周(E組)，以后逐漸減少，但仍高于對照組；即使復氧1月(G組)，Caspase-3的表達仍高于對照組。細胞凋亡主要由Caspases級聯反應過程控制[7]，而Caspase-3是Caspases家族的核心成員，在蛋白酶級聯切割過程中處于核心位置，其表達與激活在神經細胞的凋亡中扮演重要角色[8]。Westen Blot檢測發現，在早期CIH組A組，海馬區神經元NRl蛋白表達量較對照組變化有增高趨勢，而B、C、E、F及G組，小鼠海馬神經元NR1蛋白的表達均降低，其中C、E組降至最低水平。NMDA受體是興奮性神經遞質谷氨酸親離子型受體的一種，目前已發現存在7個亞單位，其中NR1是該受體核心的功能亞單位，海馬區NR1與LTP現象的產生密切相關。LTP現象是中樞神經系統可塑性的一種理想模式，是學習和記憶的神經基礎[4]，在大多數LTP的誘導過程中，與NMDA受體藕聯的Ca2+通道起了重要作用。本研究結果表明，在CIH早期，興奮性神經遞質谷氨酸增多，刺激NR1激活，但隨著低氧時間延長，NR1的過度激活，對腦組織產生興奮性毒作用，引起離子通道病理性開放，Ca2+大量內流，造成胞內鈣超載，產生大量自由基、神經元蛋白質和磷脂代謝紊亂，線粒體能量傳遞異常，啟動細胞凋亡機制，激活Caspase-9基因和下游的Caspase-3基因，使得海馬神經元凋亡[17-18]，導致學習記憶功能受損。

本研究認為，海馬鈣信號轉導系統中NR1受體通過調控細胞內復雜的信號轉導鏈，影響LTP的誘導和維持，使突觸可塑性改變；并介導細胞內鈣超載，激活下游的Caspase-3基因，誘導細胞發生凋亡，從而發揮對學習記憶功能的調節作用。本研究結果對OSAS導致認知障礙的機制進行了初步探討，為進一步的干預治療提供了值得關注的新靶點。

參 考 文 獻

1 李濤平. 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征與多器官疾病的關系[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版，2011，4(4)：259-264.

2 Chiang AA. Obstructive sleep apnea and chronic intermittent hypoxia:a review[J]. Chin J Physiol, 2006, 49(5): 234-243.

3 Nair D, Dayyat EA, Zhang SX, et al. Intermittent hypoxia-induced cognitive deficits are mediated by NADPH oxidase activity in a murine model of sleep apnea[J]. PLoS One, 2011, 6(5): e19847.

4 Bliss TV, Collingridge GL. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus[J]. Nature, 1993, 361(6407): 31-39.

5 Lau CG, Zukin RS. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders [J]. Nat Rev Neurosci, 2007, 8(6): 413-426.

6 Huo XL, Min JJ, Pan CY, et al. Efficacy of lovastatin on learning and memory deficits caused by chronic intermittent hypoxia-hypercapnia: through regulation of NR2B-containing NMDA receptor-ERK pathway[J]. PLoS One, 2014, 9(4): e94278.

7 Kumar S, Dorstyn L. Analysing caspase activation and caspase activity in apoptotic cells[J]. Methods Mol Biol, 2009, 559: 3-17.

8 Lu ZQ, Deng YJ, Lu JX. Effect of aloe polysaccharide on caspase-3 expression following cerebral ischemia and reperfusion injury in rats[J]. Mol Med Rep, 2012, 6(2): 371-374.

9 Bucks RS, Olaithe M, Eastwood P. Neurocognitive function in obstructive sleep apnoea: a meta-review [J]. Respirology, 2013, 18(1): 61-70.

10 Chen R, Xiong KP, Huang JY, et al. Neurocognitive impairment in Chinese patients with obstructive sleep apnea hypopnea syndrome[J]. Respirology, 2011, 16 (5): 842-848.

11 Ayalon L, Ancoli-Israel S, Aka AA, et al. Relationship between obstructive sleep apnea severity and brain activation during a sustained attention task [J]. Sleep, 2009, 32(3): 373-381.

12 Ward CP, McCoy JG, McKenna JT, et al. Spatial learning and memory deficits following exposure to 24 h of sleep fragmentation or intermittent hypoxia in a rat model of obstructive sleep apnea[J]. Brain Res, 2009, 1294: 128-137.

13 Row BW, Kheirandish L, Cheng Y, et al. Impaired spatial working memory and altered choline acetyltransferase (CHAT) immunoreactivity and nicotinic receptor binding in rats exposed to intermittent hypoxia during sleep[J]. Behav Brain Res, 2007, 177(2): 308-314.

14 Yang XH, Liu HG, Liu X, et al. Thioredoxin and impaired spatial learning and memory in the rats exposed to intermittent hypoxia[J]. Chin Med J (Engl), 2012, 125(17): 3074-3080.

15 Cai XH, Li XC, Jin SW, et al. Endoplasmic reticulum stress plays critical role in brain damage after chronic intermittent hypoxia in growing rats[J]. Exp Neurol, 2014, 257: 148-156.

16 Wang Y, Zhang SX, Gozal D. Reactive oxygen species and the brain in sleep apnea[J]. Respir Physiol Neurobiol, 2010, 174(3): 307-316.

17 Barhwal K, Hota SK, Baitharu I, et al. Isradipine antagonizes hypobaric hypoxia induced CA1 damage and memory impairment: Complementary roles of L-type calcium channel and NMDA receptors [J]. Neurobiol Dis, 2009, 34(2): 230-244.

18 Estaquier J, Vallette F, Vayssiere JL, et al. The mitochondrial pathways of apoptosis [J]. Adv Exp Med Biol, 2012, 942: 157-183.