結核感染T細胞斑點試驗對肺結核的臨床診斷價值

李林陽 陳林利 李 琦

結核病一直是人們關注的全球性健康問題。據世界衛生組織統計，全球約有1/3人口受到結核分枝桿菌感染。結核病在我國的發病率位居世界第二，且發病率呈逐年上升趨勢，每年約有13萬人死于結核病[1]。結核病是由結核桿菌感染引起的慢性傳染病。傳統的結核病診斷方法如痰涂片抗酸染色、結核菌素皮試(tuberculin skin test, TST)、結核抗體(tuberculosis antibody, TB-Ab)、血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR)及影像學檢查等敏感性及特異性不高，而“結核分枝桿菌培養”作為診斷結核的金標準，特異性雖高，但敏感性低，并且培養時間較長。因此尋找敏感性及特異性較高的快速診斷結核感染的檢測方法對于結核疾病的控制與預防十分重要。結核感染T細胞斑點試驗(Tuberculous infection of T cells spot test, T-SPOT.TB)是由酶聯免疫斑點(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)試驗發展而來檢測結核疾病的新型方法。其作用原理為使用結核分枝桿菌特異性抗原刺激外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，通過細胞因子干擾素(interferon-γ, IFN-γ)的分泌檢測抗原特異性T淋巴細胞的應答反應情況，進而對患者的結核感染狀態進行判斷。本研究通過回顧性分析，對比T-SPOT.TB試驗和其它常規方法檢測結果，評價T-SPOT.TB試驗的臨床輔助診斷價值。

對象與方法

一、研究對象

回顧分析2014年1月至2014年7月入住我院呼吸科的患者，共122例，其中確診肺結核者64例，其中男35例，女29例，年齡21～78歲，平均年齡 48.3歲，其中菌陽28例，病理確診17例，抗結核治療病灶明顯吸收者19例；非結核組患者58例，其中男26例，女32例，年齡范圍20～81歲，平均年齡51.7歲，均通過臨床癥狀、實驗室檢查、病理、影像學及臨床療效明確排除結核可能。兩組患者均采集詳細病史，并完成T-SPOT.TB、血沉、結核抗體、痰涂片抗酸染色、結核菌素純蛋白衍生物(purified prote in derivatives, PPD)皮試等檢查。

1.入選標準

結核組：菌陽(痰液、纖支鏡刷檢及灌洗液)；病理明確干酪樣壞死；經診斷性抗結核治療臨床癥狀明顯改善，影像學病灶明顯吸收。

非結核組：菌陰(痰液、纖支鏡刷檢及灌洗液)；病理診斷為明確非干酪樣壞死；無結核密切接觸史；經非抗結核治療臨床癥狀及病灶影像學明顯改善。

2.排除標準: 以上病例均滿足：HIV抗體陰性；近期無嚴重病毒感染史；無嚴重的肝腎功能衰竭；近期無輸血及PET-CT；無免疫抑制劑用藥史及放化療治療。

二、研究方法

1. ESR：男患>15 mm/1 h 女患>20 mm/1 h為陽性 反之為陰性。

2. 痰涂片抗酸染色：每例患者至少3次痰檢，1次為陽性即可。

3. PPD試驗：對所有入選患者左前臂曲側中上部1/3處皮下注射5 IU(0.1 ml)人型純蛋白衍生物(PPD)試劑，實驗后48～72 h觀察和記錄結果，硬結直徑≥5 mm判定為陽性。

4. TB-Ab：具體操作按試劑盒。

5. T-SPOT.TB 檢測技術

(1)操作步驟：采集肝素鋰抗凝的外周血5 ml行外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分離，用全血模式進行細胞計數，配制成終濃度為每100ul中含25萬個單個核細胞的細胞懸液；在每個樣本的板條上按順序設置陰性對照、抗原A(早期分泌性靶抗原6 ESAT-6)、抗原B(濾液培養蛋白10 CFP-10)、陽性對照，再按上述順序，在4個孔中分別加入已制備好的終濃度細胞懸液100 μl，將培養板放入37.0 ℃、5% CO2濃度培養箱中培養16～20 h，PBS洗板4次；每孔加入50 μl新鮮配制的酶標二抗工作液，在2～8 ℃條件下孵育1 h，PBS洗板4次；每孔加入50 μl顯色液，避光顯色7～12 min，蒸餾水終止顯色3～4次，使用濾紙拍板，自然干燥后進行結果判讀，干燥后的板條可在干燥避光條件下長期保存。

(2)結果判讀：陰性對照孔斑點數為0～5個時：(抗原A孔或抗原B孔斑點數)減去(陰性對照孔斑點數)≥6，為“陽性”；陰性對照孔斑點數為6～10個時：(抗原A孔或抗原B孔斑點數)≥2*(陰性對照孔斑點數)，為“陽性”；如不符合上述標準，且陽性對照孔正常時檢測結果為“陰性”。

三、統計學方法

數據分析用SPSS 17.0軟件，計數資料采用卡方檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義，T-SPOT.TB檢測與傳統檢測方法的靈敏度、特異度兩兩比較的檢驗水準α′取0.0167。

結 果

122例患者中，結核患者64例，非結核患者58例，T-SPOT.TB檢測肺結核靈敏度為90.63%， 特異度為87.93%， 假陰性率為9.37% ，假陽性率為12.07%，陽性預測值為89.23%，準確度符合率為89.34% 。T-SPOT.TB診斷結核的靈敏度顯著高于TB-Ab(χ2=25.301，P<0.001)和ESR(χ2=5.489,P=0.019)，但與PPD無顯著差異(χ2=0.321，P=0.571)；特異度顯著高于PPD(χ2=22.543，P<0.001)、TB-Ab(χ2=5.254，P=0.022)和ESR(χ2=20.993，P<0.001)；陽性預測值89.23%顯著高于PPD(χ2=12.266，P<0.001)、TB-Ab(χ2=9.622，P=0.002)和ESR(χ2=14.176，P<0.001)；診斷符合率89.34%顯著高于PPD(χ2=16.521，P<0.001)、TB-Ab(χ2=28.024，P<0.001)和ESR(χ2=24.344，P<0.001)，見表1。確診結核患者中，涂陽、涂陰兩組T-SPOT.TB檢測陽性檢出率分別為92.86%，88.89%，差別無統計學意義(P>0.05)，見表2。

討 論

結核病是全球嚴重的公共衛生問題之一。據WHO估計, 全球有約20 億人感染結核分枝桿菌,每年有約200萬人死于結核。我國是世界上22個結核病高負擔國家之一, 每年約有13萬人死于結核病。隨著老年患者、耐藥患者、合并糖尿病、免疫損害等肺結核患者的增多，結核癥狀易被并發癥和其它癥狀掩蓋，給臨床診斷帶來極大的困難。因此尋找敏感性及特異性較高的快速診斷結核感染的檢測方法不僅可使患者盡早恢復健康，而且是消除傳染源、控制結核病流行最重要的措施。

表1 4種檢查方法的靈敏度、特異度、陽性預測值、準確度符合率比較

注：T-SPOT.TB：T結核感染細胞斑點試驗；PPD試驗：純蛋白衍生物；TB-Ab：結核抗體； ESR：血沉

表2 64例確診肺結核患者涂陽、涂陰組T-SPOT.TB試驗陽性檢出率比較

臨床上傳統診斷結核的方法存在諸多缺陷，TST雖然快速，但在易受結核感染的免疫力低下人群中，其敏感性反而大大降低，導致臨床漏診率高；PPD是200多種蛋白的混合物, 其中很多是非結核分枝桿菌及卡介苗(BacillusCalmette-Gurin, BCG)的共同抗原成分, 尤其在普遍接種BCG 的地區造成較高的“假陽性”率。而且，皮試的操作和結果的解釋存在主觀依賴性，降低了檢查的準確性；組織病理學檢查為有創性，風險大，達不到快速診斷目的；痰涂片抗酸染色盡管簡便、快捷，但敏感性及特異性低。大量資料顯示，當痰液中分枝桿菌含量為1000～10 000/ml時，其痰涂片陽性率為40%～50%，表明大量的涂陰結核患者未被檢出，而且涂陽患者也不能區分是結核菌還是非結核分枝桿菌。“結核分枝桿菌培養”作為診斷結核的金標準，特異性雖高但敏感性低，并且培養時間一般為2～8周，并且受到標本細菌數量的影響，容易出現假陰性。

T-SPOT實驗結合了酶聯免疫斑點技術(即ELISPOT技術)與γ-干擾素釋放試驗，通過檢測受結核分枝桿菌抗原刺激而活化的效應T細胞來診斷結核感染。結核感染后體內長期存在抗原特異性T細胞，當再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增殖，釋放γ-干擾素。實驗中利用ESAT6和CFP10兩種結核特異性抗原刺激外周血中結核特異性T淋巴細胞分泌γ-干擾素，并通過ELISPOT方法檢測γ-干擾素的釋放水平(即斑點的多少)，從而判斷機體是否感染了結核桿菌。對活動性結核分枝桿菌感染具有較高的敏感性[2-3]。ESAT6和CFP10均來自結核分枝桿菌基因組RD1區域，且僅有結核分枝桿菌復合群存在RD1區，所有的卡介苗和大多數環境分枝桿菌均缺失該區域。因此，該檢測不受卡介苗接種、環境分枝桿菌感染的影響，特異性強，是目前早期發現結核病最有效的檢測手段。

研究顯示，T-SPOT.TB檢測對于潛伏性感染及活動性結核具有較高敏感性和特異性。Madariaga等[4]對47例痰菌陽性患者進行檢測，結果表明T-SPOT.TB檢測診斷活動性肺結核比結核菌素敏感性高。Lalvani等[5-6]的研究顯示T-SPOT.TB檢測對免疫功能正常的成年人活動性結核診斷的敏感性為83～97%，綜合敏感性為90%。趙靜等[7]對于43例菌陽肺結核患者進行T-SPOT.TB檢測敏感性為93.0%，且T-SPOT.TB檢測的特異性明顯高于血結核抗體檢測。本研究結果顯示T-SPOT.TB檢測診斷肺結核病的敏感度為90.63% 特異性87.93% 假陰性率9.37% 假陽性率12.07%，符合準確率89.34% 。本研究結果與文獻報道相近。本試驗結果中痰涂片抗酸染色陽性率為43.75%(28/64)，顯然低于T-SPOT.TB陽性率90.62%(58/64)，盡管PPD試驗敏感性與T-SPOT.TB相近，但PPD試驗特異性僅為46.55%，顯著低于T-SPOT.TB。有Meta分析指出PPD的診斷敏感性為78.7%～81.6%，然而其特異性僅為52.4%～57.9%[8]。本試驗結果中PPD特異性為46.55%，低于文獻報道，可能是由于我國卡介苗預防接種率高，導致PPD假陽性率增高所致。T-SPOT.TB則避免了卡介苗、非結核桿菌的交叉反應，大大提高了特異性，故在卡介苗高接種率的我國推廣T-SPOT.TB檢測意義重大。2006年Ferrara等[9]試驗研究得出T-SPOT.TB與PPD兩種方法在診斷結核感染的一致率為75.9%。魏娟等[10]通過試驗也得出兩者在診斷結核感染有較好的吻合性，因此T-SPOT.TB在臨床中結合PPD結果能提高診斷效率。

在臨床實踐中，因受痰菌含量的影響，導致痰菌涂陽率低下，臨床大量痰菌涂陰的結核患者易漏診。確診結核患者中，涂陽、涂陰兩組T-SPOT.TB檢測陽性檢出率分別92.86%，88.89%，P>0.05，提示T-SPOT.TB檢測與結核患者是否排菌無關，明顯降低了漏診率。結核組中，T-SPOT.TB檢測有6例陰性，均為入院前抗結核治療，導致效應T細胞消失，使斑點數減少，呈陰性。有相關報道指出，治療有效的病例T-SPOT.TB斑點數減少，甚至陰性。因此T-SPOT.TB檢測可作為抗結核療效的評估。盡管T-SPOT.TB 難以區分活動性結核和潛伏性結核感染，但相關文獻報告T-SPOT.TB檢測仍然存在著結核活動程度越高斑點數越多的趨勢，即T-SPOT.TB的斑點數越多, 發生活動性結核的可能性越大，而且短期內有過結核接觸史的患者T-SPOT.TB的斑點數較多時更有意義[11-12]。此外，對于T-SPOT.TB 陽性的人群，定期的復查監測斑點數的變化是很有必要的。如果T-SPOT.TB 的斑點數在短時間內顯著增加，則強烈提示體內結核活動，這可為臨床抗結核治療提供很重要的依據。

綜上所述，T-SPOT.TB檢測是以ELISA POT 技術檢測結核感染的新方法，ELISPOT 技術是近20年發展起來的檢測抗原特異性T細胞的技術，是目前最敏感的檢測抗原特異性T細胞的方法之一，其靈敏度優于結核抗體、抗酸桿菌，特異度優于PPD、血沉，準確度優于傳統診斷結核的方法，對抗結核療效有評估價值，是早期快速診斷，有效避免漏診、誤診的方法。在結核病高發的我國值得推廣。

參 考 文 獻

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