mytoxin B和myrothecine A抑制肝癌細胞SMMC-7721增殖的分子機制

徐化潔, 呂豐偉, 程文婷, 劉明艷,張 瑾, 申 麗, 傅 奕

(揚州大學醫學院, 1. 09級臨床本科; 2. 生物化學教研室; 3. 藥學教研室, 江蘇 揚州, 225001)

生物毒素作為一類特殊的天然產物，因其高生物活性、對特定靶位的高度選擇性和作用靶位及作用機制的多樣性等特點引起科研人員的高度關注。目前很多生物毒素得到研究，并成功開發應用于臨床，如長春花堿、喜樹堿等植物毒素，生物毒素已成為抗腫瘤新藥的重要來源[1-2]。

單端孢霉烯大環內酯是漆斑菌Myrothecium sp.、毛殼菌Chaetomium sp.、黑色葡萄狀穗菌 Stachybotrys sp.、擬莖點霉菌 Phomopsis sp. 等真菌產生的一類真菌毒素，是單端孢霉烯的4β和15位二酰化后形成的大環內酯，具有豐富的結構類型和顯著的抗腫瘤活性[3-6]，特別是非大環類似物單端孢霉烯anguidine曾進入二期臨床研究[7-8]。早期研究[9]表明，單端孢霉烯及其大環內酯通過抑制腫瘤細胞蛋白質合成而發揮強抗腫瘤作用，而這正是他們產生毒性的主要原因。因此，研究單端孢霉烯大環內酯的抗腫瘤分子機制，對其化學結構修飾與改造以提高活性和靶向性、降低毒性非常關鍵。單端孢霉烯大環內酯作為抗腫瘤活性物質得到廣泛研究[10-11]，但抗腫瘤機制文獻報道較少[12]。

mytoxin B和myrothecine A是從黃花蒿內生真菌 M. roridum IFB-E012發酵液中分離獲得的單端孢霉烯大環內酯化合物[5], mytoxin B分子結構的倍半萜部分含有12,13-環氧環，myrothecine A為mytoxin B的10,13-碳環單端孢霉烷衍生物(10,13-碳環衍生物目前只在共生菌中發現[14-15])。文獻[13]表明，12,13-環氧環對單端孢霉烯大環內酯的抗腫瘤活性影響顯著。為在分子水平揭示12,13-環氧環對抗腫瘤活性的影響，本文以肝癌細胞SMMC-7721為研究對象，觀察mytoxin B和myrothecine A對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用，并初步探討了分子機制，為進一步抗腫瘤機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

mytoxin B和myrothecine A為本課題組分離提取[5]，用10%二甲亞砜(DMSO)配成1 mg/mL濃度存儲液備用。細胞培養所用高糖DMEM為GIBCO公司產品，小牛血清購自山東銀香偉業公司。小鼠抗人p27單克隆抗體(F-8)為Santa Cruz產品，小鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自上海康成生物公司，辣根過氧化酶標記的羊抗小鼠二抗購自北京博士德公司。質粒pSi-p27-469及pSi-con對照質粒為本實驗室構建保存[16]。

1.2 細胞培養

肝癌細胞SMMC-7721為本室保存。肝癌細胞SMMC-7721在含有10%新生牛血清的DMEM中常規培養(37 ℃, 5% CO2), 取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 質粒轉染

按Invitrogen公司LipofectamineTM 2000轉染說明書進行。具體方法如下：將5×105個細胞加入6孔培養板中，培養至細胞融合90%以上。平行配制轉染試劑Lipofectamine的無血清DMEM稀釋液(10 μL脂質體+250 μL無血清DMEM)以及質粒的無血清稀釋液(質粒+250 μL無血清DMEM)。混合上述兩管液體，輕輕混勻，室溫靜置20 min以形成DNA-Lipofectamine復合物。與此同時棄去細胞舊培養液，換以無抗無血清的DMEM 1.5 mL。將上述配制的500 μL DNA-Lipofectamine混合物加入細胞中，輕晃6孔板以混合均勻，孵育6 h后，換用含10%新生牛血清的完全培養液，繼續培養。然后分別于轉染后的24、48 h收集細胞，進行Western blot檢測。

1.4 MTT測定細胞增殖

取加藥處理的細胞，以1×104個細胞/孔接種于96孔板。接種后48 h, 每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL), 繼續孵育4 h。然后棄去培養液，每孔加入150 μL DMSO, 37 ℃振蕩10 min, 使結晶充分溶解，酶標儀在波長490 nm處測定各孔吸光度值。以5-氟尿嘧啶(5-Fu)為陽性對照。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期

細胞接種于6孔板中，待生長至70%左右匯合時加藥處理。48 h后，收集細胞，300目濾網過濾制成單細胞懸液, 1 500 r/min離心10 min, 棄上清。用預冷的70%乙醇固定細胞, -20 ℃固定過夜。3 000 r/min離心10 min除去乙醇，加入1 mL PBS懸浮細胞，離心。細胞計數，調整細胞濃度為1×106細胞/mL。將細胞重懸于50 μg/mL的碘化丙錠染液中(其中含RNaseA，終濃度為20 μg/mL), 37 ℃保溫30 min。細胞進行流式測定，應用ModFit LT3.0軟件分析細胞周期中各期細胞所占總細胞的百分率。

1.6 Western blot

取加藥處理或轉染后的細胞，棄去培養液，以預冷的PBS洗滌2次，加入相應體積的1×SDS蛋白裂解液，冰上放置30 min。以刮棒刮下細胞，沸水浴10 min, 然后4 ℃, 12 000 r/min離心10 min。取上清，用改良Lowry法進行蛋白定量。調整樣品蛋白質濃度使其相等，保證每個樣品孔蛋白上樣量一致。蛋白質經SDS-PAGE后，轉移至PVDF膜上。PVDF膜以5%脫脂奶粉封閉4 h后，加入一抗過夜。經洗滌后，再加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫下反應3～4 h。每步反應結束均用PBST洗滌3次, 10 min/次。最后用ECL化學發光，經曝光、顯影、定影后，膠片晾干保存，掃描后用Image J軟件進行圖像定量分析。

2 結 果

2.1 mytoxin B和myrothecine A對肝癌細胞SMMC-7721增殖的影響

SMMC-7721細胞經不同濃度的mytoxin B和myrothecine A分別作用48 h后，采用MTT法測定細胞增殖。結果發現，mytoxin B在0.1 g/mL時就可明顯抑制細胞增殖，抑制率為41%，但隨著濃度的增加，并未呈現出劑量依賴性; myrothecine A在濃度為0.5 g/mL時表現出抑制細胞增殖的作用，抑制率為22%, 濃度為1 g/mL時抑制作用更為明顯，抑制率為38%, 并隨著濃度增加呈現出劑量依賴性；而陽性對照5-Fu在5 g/mL時才明顯表現出抑制細胞增殖的活性，抑制率為25%(圖1)。

Compared with NC, *P<0.05, **P>0.01

2.2 mytoxin B和myrothecine A誘導肝癌細胞SMMC-7721細胞周期阻滯

細胞增殖受到細胞周期的調控，采用流式細胞儀可測定mytoxin B和myrothecine A對SMMC-7721細胞周期的影響。mytoxin B和myrothecine A在1 g/mL濃度時皆可明顯抑制細胞增殖，因此，相關的機制實驗均采用1 g/mL濃度的藥物處理細胞。

流式細胞儀檢測結果顯示，與陰性對照細胞NC相比，mytoxin B和myrothecine A處理細胞后, G0/G1期的細胞比例均減少，分別為53.80%和59.73%(對照組為67.65%); 而S期的細胞比例增加，分別為46.2%和39.42%(對照組為31.30%)(圖2)。上述結果提示，mytoxin B和myrothecine A都可不同程度導致S期細胞增多，即S期細胞周期阻滯，這可能是導致細胞增殖抑制的原因。

圖2 mytoxin B和myrothecine A對肝癌細胞株SMMC-7721細胞周期的影響

2.3 mytoxin B和myrothecine A上調SMMC-7721細胞中p27的表達

細胞周期的運轉受到許多蛋白因子的協調控制。p27是一種重要的細胞周期負調控蛋白，它可與cyclinD1/CDK4及cyclinE/CDK2復合物結合，特異性地抑制CDK2和CDK4的激酶活性，導致細胞周期阻滯，從而抑制細胞增殖[17]。為探討mytoxin B和myrothecine A誘導S期細胞周期阻滯的機制，本文采用1 g/mL的mytoxin B和myrothecine A分別處理SMMC-7721細胞48 h后，收集細胞蛋白，用Western blot測定細胞周期負調控蛋白p27的含量。實驗以未加藥孔蛋白作陰性對照(NC)，GAPDH為內參。結果發現，mytoxin B和myrothecine A皆可導致p27蛋白表達明顯增加，分別為陰性對照的1.6倍和1.9倍(圖3)。

Compared with NC, *P<0.05, **P<0.01

2.4 p27 shRNA可部分阻斷mytoxin B和myrothecine A誘導的細胞增殖抑制

為證明p27蛋白表達的上調與mytoxin B和myrothecine A誘導的細胞增殖抑制相關，本文在SMMC-7721細胞中轉染pSi-p27-469質粒(pSi-p27)[16]，并以轉染pSi-nonsense(pSi-con)作為對照，在轉染的同時加入mytoxin B和myrothecine A處理細胞。然后分別在轉染后的24、48 h收集細胞，收集的細胞一部分進行MTT測定，一部分提取蛋白進行Western blot檢測。Western blot結果顯示，轉染24 h后，SMMC-7721細胞中的p27蛋白含量沒有明顯變化；而轉染48 h后，p27蛋白的表達明顯減少(圖4)。MTT結果也顯示，轉染pSi-p27 24 h后，mytoxin B和myrothecine A的細胞增殖抑制作用沒有受到影響；而轉染48 h后, mytoxin B和myrothecine A所致的細胞增殖抑制可被逆轉(圖4)。在mytoxin B處理的細胞中，轉染pSi-p27可使細胞增殖率恢復20%; 而在myrothecine A處理的細胞中，下調p27蛋白的表達幾乎使細胞增殖抑制完全被阻斷。

**P<0.01

3 討 論

研究表明，12,13-環氧環對單端孢霉烯大環內酯的抗腫瘤作用影響顯著。本文觀察mytoxin B和myrothecine A對SMMC-7721細胞增殖的影響時發現，他們皆可抑制SMMC-7721細胞的增殖，但作用特點不同: mytoxin B在0.1 g/mL時就表現出明顯的抑制作用，但沒有劑量依賴性，提示mytoxin B的增殖抑制作用在低濃度時就可能已達飽和；而myrothecineA在0.5 g/mL濃度時具有明顯抑制作用，且隨著濃度的增加呈現劑量依賴性。進一步的細胞周期分析顯示，mytoxin B和myrothecine A都可不同程度導致S期細胞周期阻滯，SMMC-7721細胞的增殖受到抑制。

細胞的增殖受到細胞周期的精密控制，而細胞周期運轉則需要許多蛋白因子的協調控制，主要包括正性調節蛋白和抑制性調控因子[18]。細胞周期的抑制性調控因子主要指細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑(CKIs), 包括兩類：一是INK4(inhibitor of CDK4)蛋白家族，一是CIP/KIP蛋白家族。p27是CIP/KIP蛋白家族的重要成員，已發現p27的蛋白表達量與腫瘤的發生、發展及預后密切相關，被看做是一種潛在的抑癌蛋白[19]。因此，本文采用Western blot測定p27蛋白的含量，以探討mytoxin B和myrothecine A誘導的細胞增殖抑制與p27蛋白的關系。結果發現，mytoxin B和myrothecine A都可以增加p27蛋白的表達，提示mytoxin B和myrothecine A可能通過上調p27的表達誘導S期細胞周期阻滯，進而抑制SMMC-7721細胞增殖。為進一步證明該機制，本文利用p27 shRNA質粒下調p27蛋白的表達，以觀察mytoxin B和myrothecine A誘導的細胞增殖抑制是否受到阻斷。結果發現，在myrothecine A處理的SMMC-7721細胞中，細胞增殖的抑制幾乎完全被阻斷，表明myrothecine A正是通過增加p27蛋白的表達而抑制細胞增殖。而mytoxin B處理的細胞中，下調p27蛋白的表達只起到部分阻斷作用，提示還有其他機制可能參與了mytoxin B引起的細胞增殖抑制，有待進一步探討。

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