高壓氧治療小鼠一氧化碳中毒所致遲發(fā)性腦病的療效及其對(duì)病理機(jī)制的影響

馮樹(shù)行, 王 靜, 顏永紅, 胡懷強(qiáng), 曹秉振

(1. 第二軍醫(yī)大學(xué)濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院, 山東 濟(jì)南, 250031; 2. 解放軍第四六三醫(yī)院, 遼寧 沈陽(yáng), 110046)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康C57-6小鼠48只，體質(zhì)量18～24 g, 平均20 g，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫 (24±2) ℃的環(huán)境中，維持光、暗 12 h循環(huán)交替，并給予充足的食料和潔凈飲水。將小鼠隨機(jī)分為A、B、C組，A組為空氣對(duì)照組8只，B組為CO中毒組20只, C組為CO中毒組20只。

1.2 建造模型

所有小鼠逐個(gè)測(cè)重、標(biāo)記，40只小鼠建造CO中毒模型(濟(jì)南市氣體廠提供99.9%); A組給予空氣(100 mL/kg)腹腔注射，連續(xù)7 d，作對(duì)照；B組給予 CO(100 mL/kg)腹腔注射，連續(xù)7 d; C組給予CO(100 mL/kg)腹腔注射，連續(xù)7 d, 并于CO中毒后0.5 h立即高壓氧治療, DS-II動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加壓泵。純氧大于86%，注意保暖，加壓、減壓各20 min, 治療1 h, 連續(xù)7 d。

中毒癥狀: CO中毒約10 min出現(xiàn)癥狀，萎靡、少動(dòng), 0.5 h后，出現(xiàn)口唇、爪、尾巴顏色變紅，呼吸急促、呼吸幅度明顯增大，不活動(dòng)，聚堆。有的出現(xiàn)輕度的興奮和躁動(dòng)；再加重表現(xiàn)四肢癱軟無(wú)力、行動(dòng)遲緩；昏迷，大幅度呼吸，頻率減慢，仰臥不動(dòng)，隨后死亡。高壓氧組中毒0.5 h后，呼吸明顯急促，幅度加大，通過(guò)高壓氧治療，癥狀明顯減輕。

1.3 實(shí)驗(yàn)取材

中毒后每天反復(fù)觀察4次以上，時(shí)間超過(guò)2 h，各組中再次出現(xiàn)活動(dòng)減少、反應(yīng)遲緩、刺激后躲避差，作為可疑腦病小鼠，盡量平均分配到每次取材中。1周后，B、C組確保1只出現(xiàn)癥狀的小鼠，各共取2只，A組2只，在嚴(yán)格的無(wú)菌操作下，氯胺酮(1 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，俯臥位，打開(kāi)顱腔，取出腦組織，并分離出一側(cè)大腦、小腦，以及切開(kāi)脊椎骨，分離暴露出脊髓，剝出脊髓，去掉馬尾與脊膜，同時(shí)取小鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，一同置于4%多聚甲醛以及 2%戊二醛中固定。分別在2周、3周、4周同樣取材，最后進(jìn)行檢查。

1.4 組織病理染色

石蠟切片的制備: ① 固定。將腦組織、脊髓、坐骨神經(jīng)分別固定于10%中性甲醛緩沖液中24～48 h; ② 脫水。將固定好的組織經(jīng)自來(lái)水沖洗30 min后，依次放入75%乙醇4～5 h, 85%乙醇過(guò)夜, 90%乙醇2 h, 100%乙醇Ⅰ 1～2 h, 100%乙醇Ⅱ 1 h; ③ 透明。分別置于100%乙醇、二甲苯(1︰1)10 min, 二甲苯Ⅰ 20 min, 二甲苯Ⅱ20 min; ④ 浸蠟。分別置于石蠟Ⅰ(52～54 ℃)10 min, 石蠟Ⅱ(58～60 ℃)15 min, 石蠟Ⅲ(60～62 ℃)60 min; ⑤ 包埋。用熔點(diǎn)為60～62 ℃石蠟包埋，修塊后4 ℃保存; ⑥ 切片、黏片：蠟塊-20 ℃預(yù)冷20 min, 冠狀位切片厚約4 μm, 30%乙醇充分展開(kāi)臘片, 40～60 ℃溫水中撈片、貼片, 58～60 ℃烤片2 h烘干熔蠟。

1.5 相關(guān)檢查

1.5.1 主要儀器與設(shè)備：光學(xué)顯微鏡(日本產(chǎn)OLYMPUS-BX41TF型)，顯微照相設(shè)備(日本產(chǎn)OLYMPUS PM-10AD型)，低溫冰箱(日本產(chǎn)SANYO-MDF19型)，自動(dòng)脫水機(jī)(日本產(chǎn)櫻花TEKVIT型)，組織包埋機(jī) (日本產(chǎn)櫻花TEKTEC型)，石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA)，微電腦恒溫恒濕控制箱(德州市瑞科孵化設(shè)備廠)，DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.5.2 主要試劑：HE染色主要試劑為伊紅Y-蘇木素(國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司); KB染色主要試劑為Solent Blue 38( Alfa Aesar英國(guó))碳酸鋰(國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司)，Cresyl Violet acetate (焦油紫)(北京索萊寶科技有限公司)；Ed-1染色主要試劑為Ed-1antibody；GFAP染色試劑為GFAP antibody BA0056；MBP染色 試劑為MBP antibody，均來(lái)自博士德生物有限公司；免疫組織化學(xué)法主要試劑有免疫組化染色試劑盒、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、PBS磷酸緩沖液、濃縮型DAB試劑盒，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩獨(dú)立樣本進(jìn)行t檢驗(yàn)，率比較采用χ2檢驗(yàn)。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

1周內(nèi)B組死亡9只，C組死亡5只; 2周后B組死亡3只，C組死亡1只; 2周后無(wú)死亡。A組無(wú)死亡。見(jiàn)表1。

表1 各組治療效果比較[n(%)]

病理結(jié)果: HE染色:表現(xiàn)為染毒后1周海馬神經(jīng)元、小腦浦肯野細(xì)胞明顯丟失，大腦皮層神經(jīng)元可見(jiàn)到變性丟失，大腦皮層第5層的錐體細(xì)胞可見(jiàn)到萎縮嗜伊紅深染。第2～4周皮層神經(jīng)元仍見(jiàn)到變性壞死。高壓氧組，表現(xiàn)相同變化，但程度減輕。第2周GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),高壓氧組明顯少于中毒組(見(jiàn)圖1); ED-1陽(yáng)性細(xì)胞從染毒第1周即出現(xiàn)，分布的皮層、大腦半球白質(zhì)、小腦及脊髓等組織。第2周開(kāi)始陽(yáng)性細(xì)胞廣泛見(jiàn)于大腦半球白質(zhì)。但高壓氧組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯少于單純?nèi)径窘M。脊髓的前外側(cè)區(qū)可見(jiàn)到細(xì)胞變性丟失，高壓氧治療組情況要比單純中毒組輕微。小腦顆粒細(xì)胞、橋核神經(jīng)元及脊髓前角細(xì)胞仍保留良好。MBP標(biāo)記髓鞘堿性蛋白，從第2周開(kāi)始可見(jiàn)到大腦半球白質(zhì)結(jié)果染色活性降低，高壓氧組程度輕。 KB染色可見(jiàn)大腦及小腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，存在的髓鞘脫失，但較之單純中毒組，髓鞘損害程度較輕，且膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)略輕微。

圖1 染毒后第2周GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比較 (GFAP染色 200倍)

3 討 論

一氧化碳中毒[1]是由于在相對(duì)密閉的室內(nèi)燃燒取暖、煙囪不通、使用燃?xì)饧訜崞髁茉　⒊鞘兄惺褂妹簹馍睢⑵?chē)尾氣、個(gè)別自殺等引起。CO與血紅蛋白的親和力較氧和血紅蛋白的親和力要強(qiáng)240倍,但解離速度卻比氧和血紅蛋白的解離速度要慢3 600倍,使氧和血紅蛋白的氧解離曲線左移,阻礙血紅蛋白釋放到組織,導(dǎo)致細(xì)胞缺氧。急性CO中毒輕者，脫離環(huán)境到通風(fēng)地方，吸氧大多好轉(zhuǎn)；重度中毒患者昏迷蘇醒后，經(jīng)過(guò)數(shù)日、數(shù)周或2～3個(gè)月的清醒期(假愈期)后,又出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀[2], 稱為一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(DEACMP)[3], 癥狀表現(xiàn)為精神異常，包括哭笑無(wú)常、行為怪異、人格改變等;智能下降，反應(yīng)遲鈍，言語(yǔ)減少，不會(huì)穿衣吃飯等;錐體外系癥狀帕金森癥狀；意識(shí)障礙以睜眼昏迷、木僵等為特征,嚴(yán)重者呈持續(xù)性植物狀態(tài)；錐體系統(tǒng)癥狀，偏癱、失語(yǔ)，以及尿便障礙植物神經(jīng)癥狀等。個(gè)別出現(xiàn)周?chē)窠?jīng)損害癥狀。CO可直接影響心血管系統(tǒng),中毒程度與吸入CO的濃度和持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)[4]。DEACMP的損傷部位比較廣泛, 因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)對(duì)缺氧非常敏感,故腦部最先受累,導(dǎo)致腦細(xì)胞水腫和/或細(xì)胞間質(zhì)水腫,腦水腫又導(dǎo)致腦循環(huán)障礙,缺血性壞死,廣泛的脫髓鞘病變,導(dǎo)致遲發(fā)性腦病，最常見(jiàn)的病理改變大腦皮層也可出現(xiàn)分層壞死,蒼白球的缺血壞死, 腦白質(zhì)中出現(xiàn)融合、不融合的脫髓鞘斑片; 基底節(jié)區(qū)、海馬區(qū)及小腦有不同程度的病變, 海馬錐體細(xì)胞變性壞死消失、小腦神經(jīng)元缺損等; 腦血流出現(xiàn)異常如淤滯、血栓形成和出血等;這些改變可由CT或磁共振成像(MRI)證實(shí)[5-6]。

高壓氧(HBO)能加速碳氧血紅蛋白的解離,增強(qiáng)機(jī)體組織對(duì)一氧化碳的清除,恢復(fù)血紅蛋白攜氧能力,因此血氧分壓越高,碳氧血紅蛋白的解離以及一氧化碳的排除就越快;高壓氧能明顯提高血氧分壓、增加血氧含量,提高血中溶解氧,快速糾正和改善組織中缺氧狀態(tài)；增加ATP, 同時(shí)高壓氧也能調(diào)節(jié)腦細(xì)胞酶的活性,尤其Na+-K+酶活性，減少細(xì)胞內(nèi)Na+減輕腦水腫,減少Ca2+內(nèi)流，減輕繼發(fā)損害，提供了腦組織內(nèi)需氧最佳環(huán)境,使腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞在軸索和血管組織相對(duì)完好的基礎(chǔ)上得以盡快地修復(fù)和再生[7-9]; 另外，高壓氧有利于大腦神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù),因而對(duì)DEACMP和后遺癥的防治具有很好的作用。有文獻(xiàn)[10]報(bào)道,該病治療總有效率為70.0%～79.5%, 其相關(guān)機(jī)制有: ① 通過(guò)提高血氧含量，增加組織氧供[11-13]，改善血管通透性，減少滲出和腦水腫; ② 使腦組織局部氧濃度提高、阻止脂質(zhì)過(guò)氧化，阻止白細(xì)胞向腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，促進(jìn)失活的細(xì)胞色素氧化酶再生; ③提高血管成纖維細(xì)胞的分裂、增生，及膠原纖維的形成，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立; ④ 降低血黏，減少無(wú)氧酵解、血小板聚集等。本研究采用高壓氧治療組小鼠的大腦皮層、基底節(jié)區(qū)、海馬區(qū)、小腦等部位損傷較其他組輕，小膠質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞增生減低，表明高壓氧既能減輕直接損傷，還能減輕了繼發(fā)損傷，對(duì)DEACMP有很好的改善作用。臨床上常使用疏血通、丹參或川芎嗪注射液治療，其能改善腦循環(huán)、降低血液黏度、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞治療[14-15]。在中毒早期同時(shí)給予腦活素、奧拉西坦、胞二磷膽堿、三磷酸腺苷、煙酸、維生素C、維生素E等營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞及改善腦代謝藥物，以解除腦水腫和降低顱內(nèi)壓。腦水腫常在急性一氧化碳中毒后2 d達(dá)高峰，故及早應(yīng)用高滲脫水劑、大劑量糖皮質(zhì)激素、利尿劑等可促進(jìn)腦血液循環(huán)，維持呼吸循環(huán)功能，有助于防治腦水腫[16]。自由基清除劑、鈣通道拮抗劑、鈣超載及自由基所引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用均參與了腦組織損傷的過(guò)程。因此，在急性中毒早期給予維生素C、維生素E、超氧化物歧化酶等抗氧化劑及自由基清除劑依達(dá)拉奉治療有助于防治DEACMP。鈣通道拮抗劑尼莫地平對(duì)缺血性腦損傷有良好的保護(hù)作用，有研究[17-18]發(fā)現(xiàn)尼莫地平能顯著降低一氧化碳中毒小鼠急性期病死率和總病死率，并改善中毒所致的學(xué)習(xí)記憶能力的損傷，避免海馬神經(jīng)元延遲性死亡，阻遏單胺氧化酶活性的異常升高。

DEACMP的病程較長(zhǎng)，常伴有精神和錐體外系癥狀，積極合理的臨床治療有助于縮短病程，改善預(yù)后[19-22]。對(duì)頻繁抽搐、極度煩躁不安者對(duì)癥，給予安定等抗驚劑; 肌張力增高者使用安坦、美多巴等。積極治療并發(fā)癥，防治感染，充分休息，避免各種精神刺激和意外事件的發(fā)生[23-25]。

[1] 岳穎, 金軍, 劉建衛(wèi), 等. 急性一氧化碳中毒急救的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中醫(yī)急癥, 2012, 21(4): 60.

[2] 胡浩. 依達(dá)拉奉聯(lián)合高壓氧治療急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病30例分析[J]. 中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志, 2010, 13(1): 67.

[3] 易露. 高壓氧治療急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病的臨床療效觀察[J]. 醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐, 2014, 27(2): 187.

[4] 王承輝. 甘露醇對(duì)一氧化碳中毒患者近期癥狀的影響[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志, 2009, 23(1): 71.

[5] 何家禮. 高壓氧聯(lián)合藥物治療重度急性一氧化碳中毒臨床觀察[J]. 臨床薈萃, 2010, 25(24): 2169.

[6] 許羅俊, 周樹(shù)榮, 唐音, 等. 高壓氧對(duì)重度一氧化碳中毒休克的促醒作用[J]. 中國(guó)臨床康復(fù), 2003, 9(5): 3535.

[7] 葉任高, 陸再英. 內(nèi)科學(xué)[M]. 6版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2004: 973.

[8] 張建宏,劉金平,常勇霞,等.高壓氧治療一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病的療效觀察[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志, 2006, 9(6): 150.

[9] 張樹(shù)新. 高壓氧治療對(duì)一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病患者的影響[J]. 中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 18(4): 239.

[10] 楊廷芳, 任主軍, 郝強(qiáng), 等. 一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病的病程及預(yù)后[J]. 卒中與神經(jīng)疾病, 2007, 14: 220.

[11] 甄君, 王雪晴, 耿建紅, 等. 高壓氧聯(lián)合運(yùn)動(dòng)療法對(duì)腦梗死功能恢復(fù)的影響[J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2011, 9(9): 1348.

[12] 潘銳, 唐亞梅, 容小明等. 一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病臨床特征及危險(xiǎn)因素分析[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2012, 32(10): 787.

[13] 龍霄翱, 梁遠(yuǎn)生, 陳兵, 等. 微創(chuàng)血腫清除術(shù)后高壓氧聯(lián)合依達(dá)拉奉治療高血壓腦出血療效觀察[J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2011, 9(7): 1022.

[14] 肖端, 呂田明, 陸兵勛, 等. 半結(jié)扎腦表面動(dòng)脈構(gòu)建大鼠局灶性淋巴滯留性腦病動(dòng)物模型[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 31(1): 125.

[15] 朱瑞昉. 高壓氧聯(lián)合藥物治療急性腦梗死療效觀察[J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2011, 9(9): 1394.

[16] 尹素梅. 氣管切開(kāi)患者行高壓氧治療時(shí)的陪艙護(hù)理體會(huì)[J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2011, 9(2): 323.

[17] 楊俊卿, 周歧新. 尼莫地平對(duì)一氧化碳中毒致小鼠腦損傷保護(hù)作用研究[J]. 工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病, 2001, 27(1): 19.

[18] 戴瑛, 吳祖舜. 腦出血大鼠局部血流量的改變及尼莫地平的干預(yù)作用[J]. 臨床神經(jīng)病學(xué)雜志, 2008, 21(1): 49.

[19] 甄君, 王雪晴, 耿建紅, 等. 高壓氧聯(lián)合運(yùn)動(dòng)療法對(duì)腦梗死功能恢復(fù)的影響[J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2011, 9(9): 1348.

[20] 尹素梅. 氣管切開(kāi)患者行高壓氧治療時(shí)的陪艙護(hù)理體會(huì)[J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2011, 9(2): 323.

[21] 龍霄翱, 梁遠(yuǎn)生, 陳兵, 等. 微創(chuàng)血腫清除術(shù)后高壓氧聯(lián)合依達(dá)拉奉治療高血壓腦出血療效觀察[J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2011, 9(7): 1022.

[22] 潘銳, 唐亞梅, 容小明, 等. 一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病臨床特征及危險(xiǎn)因素分析[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2012, 32(10): 787.

[23] 龍霄翱, 梁遠(yuǎn)生, 陳兵, 等. 微創(chuàng)血腫清除術(shù)后高壓氧聯(lián)合依達(dá)拉奉治療高血壓腦出血療效觀察[J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2011, 9(7): 1022.

[24] 朱瑞昉. 高壓氧聯(lián)合藥物治療急性腦梗死療效觀察[J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2011, 9(9): 1394.

[25] 肖端, 呂田明, 陸兵勛, 等. 半結(jié)扎腦表面動(dòng)脈構(gòu)建大鼠局灶性淋巴滯留性腦病動(dòng)物模型[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 31 (1): 125.