混合型肝癌組織中OV6與Snail蛋白的表達及臨床意義

張旭光, 王 杰, 李 權, 吳 東

(1. 蘇州大學研究生院, 江蘇 蘇州, 215006; 2. 東方肝膽外科醫院, 上海, 200438)

混合型肝癌(cHCC-CC)在原發肝癌中是一個罕見的病理亞型，約占總發病人數1.5%[1-2]。雖然相對罕見，但由于其獨特的臨床病理學特征而吸引了廣泛關注。OV6作為肝祖細胞的標記物，能夠增加腫瘤的化療耐藥性[3]。Snail是一種含有鋅指結構的轉錄抑制因子，同時也是上皮間質轉化(EMT)的重要調節因子，能夠促進腫瘤的侵襲與轉移。本研究采用免疫組織化學法檢測OV6和Snail蛋白在混合型肝癌組織中的表達，探討其與混合型肝癌發生發展的關系及臨床病理學意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取1997年2月—2003年7月在本院確診為混合型肝癌并進行根治性切除的患者70例，其中男63例，女7例，平均年齡48.1歲；乙肝表面抗原(HBsAg)陽性58例(82.8%), 陰性12例(17.2%); 腫瘤平均直徑為6.1 cm。標本均經甲醛固定、石蠟包埋和4 μm厚連續切片。鼠抗人OV6單克隆抗體購于R﹠D公司，兔抗人Snail多克隆抗體購于Abcam公司。

1.2 免疫組織化學方法

對已制作好的切片常規脫蠟水化, 3%過氧化氫甲醇溶液放置10 min, 微波熱修復。加入用血清稀釋液稀釋的一抗(OV6為1∶40; Snail為1∶200), 4 ℃孵育16～22 h; 吸去抗體, 0.01 mol/L PBS緩沖液清洗3次, 5 min/次；加入PBS稀釋的二抗，37 ℃孵育30 min; 加入顯色液進行顯色，用蒸餾水終止反應；梯度乙醇脫水，封片。

1.3 陽性判定標準

OV6蛋白陽性表達于細胞質, Snail蛋白陽性表達于細胞核，隨機取5個高倍鏡視野計數, OV6的評估以陽性染色面積及強度作為判定結果[4]。無色、淡黃色(<5%)為陰性染色；棕黃色(5%～30%), 棕褐色(>30%)為陽性染色。Snail的評估以陽性細胞核的面積作為判定結果[5]。0: 無染色; +: 1%～25%; 2+: 26%～50%; 3+: >50%, 3+定義為陽性染色。

1.4 統計學方法

對分類變量用卡方檢驗或Fisher確切概率法，使用Kaplan-Meier分析法計算總生存和無瘤生存率并繪制生存曲線，組間對比用log-rank法。采用spearman做相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義，所有統計學計算通過SPSS 18.0完成。

2 結 果

2.1 OV6和Snail在混合型肝癌組織中的表達情況

OV6蛋白陽性定位于胞漿，呈棕黃或棕褐色(圖1)，陽性表達率為42.8%(30/70)。Snail蛋白陽性定位于細胞核(圖2), 陽性表達率為47.1%(33/70)。

B. 陰性染色

A. 陽性染色

B. 陰性染色

2.2 OV6和Snail蛋白表達與臨床病理學因素的關系及相關性分析

在混合型肝癌組織中, OV6和Snail蛋白表達與腫瘤數目、血AFP水平和微血管侵犯均相關(P<0.05); 而與乙肝表面抗原、腫瘤大小、肝硬化和TNM分期均無關(P>0.05), 見表1。OV6和Snail蛋白的表達呈正相關(r=0.270,P<0.05)，見表2。

表1 OV6和Snail蛋白表達與臨床病理學因素的關系[n(%)]

表2 OV6和Snail蛋白在混合型肝癌組織中的相關性分析

2.3 OV6和Snail蛋白表達與預后的關系

利用Kaplan-Meier分析法, OV6和Snail蛋白表達影響患者術后總體生存率(P<0.05), OV6蛋白表達與術后無瘤生存率無相關性(P>0.05), 而Snail蛋白表達影響患者術后無瘤生存率(P<0.05)，見圖3、4。

圖3 OV6表達與預后的關系(A: P>0.05;B: P<0.05)

圖4 Snail表達與預后的關系(A、B: P<0.05)

3 討 論

混合型肝癌是一種罕見的肝臟惡性腫瘤，由于其發生率低，因此對其臨床特點、診斷及治療方面缺乏深刻認識。越來越多的研究[6-7]發現肝癌干細胞標志物，如OV6、Epcam、AFP等。卵圓細胞標記物OV6陽性的肝癌細胞具有更高的體內成瘤能力和化療耐受性，從而有助于腫瘤的侵襲和轉移。本研究也發現在混合型肝癌組織中OV6陽性表達的患者術后總體生存率低于表達陰性的。OV6蛋白表達與腫瘤數目、血AFP水平及微血管侵犯呈正相關。與文獻[4，8]報道基本一致。Wen Yang等[3]研究也發現，肝癌組織中OV6高表達影響患者總體生存和無瘤生存率。Snail基因超家族是一種含有鋅指結構的轉錄抑制因子，包括Snail1、Snail2(Slug)和SIP1等，同時也是EMT的重要調節因子，其與E-cadherin啟動子區E-box結合而抑制E-cadherin的轉錄，從而促進腫瘤的侵襲與轉移[9-10]。近年來大量研究報道，Snail在促進腫瘤侵襲過程中獲得腫瘤干細胞特性，從而促進許多惡性腫瘤的轉移和復發。本研究也發現Snail陽性表達的患者術后總體生存率和無瘤生存率明顯低于陰性表達，其在混合型肝癌組織中的表達與腫瘤數目、血AFP水平及微血管侵犯呈正相關。這提示了Snail在混合型肝癌的發生及侵襲轉移中可能起著重要的作用，與文獻[5，11]報道基本一致。大量文獻[12-14]報道肝癌干細胞的激活與EMT的轉錄因子之間存在相關性。Kim H等報道[11]在肝癌組織中通過免疫組化和mRNA水平檢測發現包括Snail和Slug在內的誘導EMT的因子與K19的表達呈正相關，同時發現CD133表達與E-cadherin下調相關，并影響患者預后。這些結果進一步證實Snail家族作為誘導EMT的轉錄抑制因子可獲得腫瘤干性特征，促進腫瘤侵襲和轉移。目前關于OV6和Snail蛋白在腫瘤演變中的相互關系未見報道。本研究結果表明, OV6與Snail蛋白在混合型肝癌組織中的表達呈正相關(r=0.270，P<0.05)，且隨著腫瘤數目、血AFP水平及微血管侵犯的增加，兩者的表達率均升高。提示了OV6與Snail可能通過某些共同的途徑在混合型肝癌的發生及侵襲中發揮協同作用，但其機制尚不清楚，有待研究。

綜上所述，混合型肝癌是原發肝癌中少見的病理類型，臨床表現不典型，影像學檢查表現多變，術前診斷困難。聯合檢測OV6和Snail蛋白對混合型肝癌的診斷及預后判斷有一定臨床意義。

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