雷帕霉素對缺氧條件下Hep-2細胞增殖及VEGF、HIF-1α表達的影響

張軍輝,嚴家芹,趙玉林

1)鄭州大學第三附屬醫院耳鼻咽喉科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫院耳鼻咽喉科 鄭州 450052

雷帕霉素對缺氧條件下Hep-2細胞增殖及VEGF、HIF-1α表達的影響

張軍輝1)△,嚴家芹2),趙玉林3)

1)鄭州大學第三附屬醫院耳鼻咽喉科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫院耳鼻咽喉科 鄭州 450052

△男，1978年1月生，博士，主治醫師，研究方向：耳鼻喉科基礎和臨床，E-mail:zhangjunhui777@126.com

喉癌；缺氧；雷帕霉素；Hep-2；HIF-1α；VEGF

目的：探討雷帕霉素對缺氧條件下人喉癌Hep-2細胞增殖及VEGF、HIF-1α表達的影響。方法在缺氧條件下，采用MTT法檢測0、5、10、20 nmol/L雷帕霉素處理12、24、36、48、60、72 h后Hep-2細胞的增殖活性，ELISA檢測0、5、10、20 nmol/L雷帕霉素處理24 h細胞培養上清液VEGF蛋白含量的變化，Western blot檢測0、5、10、20 nmol/L雷帕霉素處理16 h細胞HIF-1α蛋白表達的變化。結果缺氧條件下雷帕霉素對Hep-2細胞仍具有明顯的增殖抑制作用，且呈濃度和時間依賴性(F濃度=253.132，F時間=213.945，P<0.05)。缺氧條件下雷帕霉素可抑制Hep-2細胞VEGF的分泌及HIF-1α蛋白的表達(F=7.045、16.218，P<0.05)。結論雷帕霉素可抑制缺氧條件下Hep-2細胞的增殖，其機制可能與抑制Hep-2細胞VEGF的分泌及HIF-1α蛋白的表達有關。

喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是頭頸部最常見的腫瘤之一。雖然近幾十年來傳統的喉癌治療方式已有很大提高，但喉癌患者總的生存率仍然很低。局部區域復發、頸淋巴結轉移和遠處轉移等是影響患者預后的主要因素[1]。喉癌的綜合治療已成為一種治療趨勢。化療對喉腔解剖結構和喉生理功能的保護作用使其在喉癌的治療中有著重要的意義，因此尋找高效、低毒的抗喉癌藥物十分重要[2]。該實驗觀察了缺氧條件下mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素對人喉癌Hep-2細胞增殖的影響；同時檢測了雷帕霉素作用后Hep-2細胞VEGF的分泌和HIF-1α蛋白表達的變化，探討雷帕霉素用作抗喉癌藥物的可能性及機制。

1 材料與方法

1.1材料人喉癌Hep-2細胞株購自南京凱基生物有限公司。RPMI 1640培養液購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司，胎牛血清購自杭州四季青工程材料有限公司，噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)等試劑購自美國Sigma公司，HIF-1α和β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz公司，辣根過氧化酶標記物山羊抗小鼠IgG(二抗)購自北京中杉金橋生物技術服務有限公司。ELISA試劑盒購自南京凱基生物有限公司。雷帕霉素購自美國Sigma公司，溶于RPMI 1640培養基制成10 μmol/L的母液，過濾除菌后-20 ℃備用。

1.2細胞培養Hep-2細胞接種于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中(每mL含青霉素和鏈霉素各100 U)，置于37 ℃、體積分數為5% CO2、飽和濕度培養箱中培養，每2 d換液1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3不同濃度的雷帕霉素作用不同時間對缺氧條件下Hep-2細胞增殖的影響消化收集對數生長期細胞，用含體積分數10%胎牛血清的培養液調整細胞密度為7.5×104個mL-1，按100 μL孔-1接種于96孔板。待細胞貼壁后分為5組，實驗組加入雷帕霉素終濃度為5、10、20 nmol/L的培養基，每個濃度設6個復孔，另設陰性對照(0 nmol/L)和空白對照(調零孔)各6個復孔。將96孔板置于缺氧培養盒(體積分數1%O2、5%CO2和94%N2，37 ℃)中繼續培養12、24、36、48、60、72 h后終止。終止前4 h每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，放回培養箱內繼續培養4 h后小心吸棄培養上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，用酶聯免疫檢測儀在570 nm處測各孔吸光度值(A值) ，計算增殖抑制率。增殖抑制率=(陰性對照組A值-實驗組A值)/陰性對照組A值×100%。

1.4不同濃度的雷帕霉素對缺氧條件下Hep-2細胞分泌VEGF的影響消化收集對數生長期細胞接種于培養瓶內，細胞貼壁后棄原培養液，PBS沖洗3遍。加入雷帕霉素終濃度為0、5、10、20 nmol/L的無血清培養基，缺氧培養盒中培養24 h后取培養上清液，1 000 r/min離心5 min，-80 ℃凍存備用，計數細胞。將樣品和標準品按100 μL/孔加入酶標板，37 ℃反應120 min。加生物素標記抗體，再加入抗人VEGF抗體工作液, 100 μL/孔，37 ℃反應60 min。加親和素-過氧化物酶復合物ABC，100 μL/孔，37 ℃反應30 min。加入終止液，100 μL/孔，37 ℃反應25 min。在酶標儀上測定各孔A450 nm值。實驗重復3次。

1.5不同濃度的雷帕霉素對缺氧條件下Hep-2細胞HIF-1α蛋白表達的影響消化收集對數生長期細胞接種于6孔板上，培養至細胞間接近融合，加入雷帕霉素終濃度為0、5、10、20 nmol/L的培養基，于缺氧培養盒中培養16 h，提取細胞總蛋白。總蛋白濃度經Bio-Rad測定后經SDS/PAGE凝膠電泳，然后轉移至PVDF膜上。封閉后加HIF-1α一抗(按1:200稀釋)4 ℃過夜。經TBST漂洗后加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h后熒光顯色，曝光、顯影和定影。掃描蛋白印跡膠片，以β-actin為內參計算各組細胞目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.6統計學處理采用SPSS 13.0處理數據。采用3×6析因設計的方差分析比較不同濃度和不同作用時間組間增殖抑制率的差異，采用單因素方差分析比較不同濃度組間Hep-2細胞VEGF與HIF-1α 蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同濃度的雷帕霉素作用不同時間對缺氧條件下Hep-2細胞增殖的影響見表1。由表1可見，雷帕霉素對Hep-2細胞增殖有抑制作用，且呈濃度和時間依賴性。

表1 缺氧條件下不同濃度的雷帕霉素作用不同時間Hep-2細胞的增殖抑制率(n=6) %

F濃度=253.132，F時間=213.945，F交互=9.367，P均<0.001。

2.2缺氧條件下不同濃度的雷帕霉素對Hep-2細胞分泌VEGF及HIF-1α蛋白表達的影響見表2，圖1。

表2 缺氧條件下不同濃度的雷帕霉素對Hep-2細胞分泌VEGF及HIF-1α 蛋白表達的影響(n=3)

圖1 雷帕霉素對缺氧誘導的Hep-2細胞HIF-1α 蛋白表達的影響

1: 0 nmol/L雷帕霉素;2: 5 nmol/L雷帕霉素;3: 10 nmol/L雷帕霉素;4: 20 nmol/L雷帕霉素。

3 討論

實體腫瘤發展過程中的一種普遍現象是缺氧，為腫瘤細胞異常增生導致供氧與耗氧比例失衡所致。缺氧使腫瘤的生物學行為發生改變，表現為惡性程度增高，侵襲性增強，更易轉移和復發，放化療的敏感性差等方面[3]。近年的研究[4]表明AKT/mTOR信號通路在喉癌組織中高表達，在喉癌發生發展中起著重要作用。Akt/mTOR信號通路活化后可以通過抑制細胞凋亡，拮抗細胞周期阻滯，促進腫瘤血管生成、侵襲及轉移參與腫瘤的發生發展[5]，呈濃度和時間依賴性。該實驗結果顯示缺氧條件下隨mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素濃度增加、作用時間延長，Hep-2細胞的增殖抑制率逐步升高。

由于腫瘤細胞的快速生長，腫瘤細胞經常處于氧缺乏環境中，因而血管生成就顯得尤為重要[6]。新生的腫瘤血管在腫瘤發生發展及侵襲和轉移過程中都扮演著十分重要的角色。腫瘤血管的生成是促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡異常導致。VEGF為促血管生成因子，是抑制腫瘤血管生成的主要靶基因[7]。該研究結果顯示，雷帕霉素作用于缺氧條件下的喉癌Hep-2細胞24 h后，細胞培養上清液中VEGF蛋白的表達隨著雷帕霉素濃度的增加呈下降的趨勢，提示雷帕霉素可能通過下調缺氧誘導的VEGF蛋白的表達來阻滯喉癌新生血管形成。

HIF-1α是人體在缺氧條件下廣泛表達的一種轉錄因子。在常氧情況下，HIF-1α易被蛋白水解酶降解，在細胞中基本檢測不到，然而在缺氧狀態下細胞HIF-1α蛋白不被降解且成倍增加，增加的HIF-1α在缺氧調控的生理病理過程中起著重要作用[8-9]。有研究[10]表明HIF-1α在喉癌組織中高表達并與喉癌新生血管的形成密切相關。該研究結果顯示，雷帕霉素作用于缺氧條件下的喉癌Hep-2細胞16 h后，細胞中HIF-1α蛋白的表達隨雷帕霉素濃度的增加呈下降的趨勢，提示雷帕霉素可能通過下調缺氧誘導的HIF-1α蛋白的表達來抑制VEGF的表達。

綜上所述，雷帕霉素可抑制Hep-2細胞增殖，其機制可能與抑制缺氧誘導的Hep-2細胞VEGF的分泌，下調HIF-1α蛋白的表達有關。該研究為雷帕霉素用于喉癌的治療提供了一定的理論基礎。

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(2014-03-17收稿 責任編輯徐春燕)

Effects of rapamycin on proliferation of hypoxia-induced laryngeal cancer Hep-2 cells and expressions of VEGF and HIF-1α

ZHANGJunhui1)，YANJiaqin2)，ZHAOYulin3)

1)DepartmentofOtorhinolaryngology，theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOncology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofOtorhinolaryngology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

laryngeal carcinoma; hypoxia; rapamycin; Hep-2; HIF-1α; VEGF

Aim: To study the effect of rapamycin on the proliferation of hypoxia induced laryngeal cancer Hep-2 cells and the expressions of VEGF and HIF-1α. Methods: MTT was used to observe the proliferation of Hep-2 cells treated with 0,5,10,20 nmol/L rapamycin for 12,24,36,48,60,72 h under hypoxia environment. ELISA was used to determine the content of VEGF in cell culture supernatant after 0,5,10,20 nmol/L rapamycin treatment for 24 h. Western blot was used to detect the expression of HIF-1α in the cells after 0,5,10,20 nmol/L rapamycin treatment for 16 h. Results: Rapamycin could inhibit the proliferation of Hep-2 cells in a dose-dependent and time-dependent manner under hypoxia(Fconcentration=253.132,Ftime=213.945,P<0.05), significantly decrease the content of VEGF in Hep-2 cell culture supernatant and the expression of HIF-1α protein(F=7.045,16.218,P<0.05). Conclusion: Rapamycin could inhibit the proliferation of Hep-2 cells under hypoxia environment, which may be involved in its inhibiting the secretion of VEGF and decreasing the expression of HIF-1α.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.025

R739.65